本站原创摘 要：对微生物发酵鱼类加工下脚料进行了初步研究.以红鱼、鲽鱼下脚料为主要原料,辅以玉米面和麸皮,进行枯草芽孢杆菌发酵,研究其发酵前后营养成分变化.结果表明：玉米面量3%、麸皮量1%、发酵时间2d、枯草芽孢杆菌接种量为3%、温度34℃时,粗蛋白含量可达78.44%.发酵后原料中蛋白含量、可溶性氮含量、乳酸含量有显著提高；发酵产物氨基酸总量高于国产鱼粉；多数氨基酸含量有不同程度的提高.
关 键 词：微生物；发酵；鱼类下脚料；营养
中图分类号：Q815文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.008
我国是渔业大国,2008年水产品总量为4890万t,占全球渔业总产量的40%.同时,我国也是世界水产品来（进）料加工贸易的主要基地,连续8年居世界水产品出口贸易首位[1].在水产品加工过程中会产生20%～40%的废弃物（鱼头、内脏、鱼皮、鱼骨等）.这些下脚料中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质等,如果不加以利用,将造成资源的极大浪费.因此,充分利用鱼类加工下脚料,不仅能提高鱼类产品的附加值,而且在减少加工业污染物排放、保护环境等方面均具有重要的现实意义[2-4].
鱼粉一直被作为水产动物饲料的主要蛋白源,每年的需求量相当大.据报道,全球渔获量的35%被用来生产鱼粉.但近年来,受全球渔业自然资源衰退的影响,世界鱼粉产量逐年下降.而日益增长的水产养殖业抬高了鱼粉的,使鱼粉的需求量呈现快速增长之势.鱼粉资源的紧缺和的上涨,给水产饲料工业带来了严峻挑战.寻求可替代鱼粉的廉价而稳定的蛋白源,成为世界各国水产养殖业必须面对和解决的首要问题[5-7].
微生物发酵饲料近年来发展迅速,用生物技术特别是微生物发酵技术来开发新型饲料资源、生产蛋白质饲料,越来越受到人们的重视.JoongKyunKim等[8]分离蚯蚓内脏的微生物,并用分离出的芽孢杆菌对鱼类废弃物进行发酵使其转化成液体肥料.通过发酵处理的饲料不仅能改变蛋白质的品质,降解饲料原料中可能存在的毒素,还能产生鱼类易消化吸收的小肽、氨基酸及生长未知因子等有益物质,起到促进生长、调节动物的微生态平衡、提高机体免疫功能的作用[9-10].
笔者以红鱼、鲽鱼下脚料为原料,采用微生物发酵法开发蛋白源,系统地研究发酵前后营养成分变化,优化发酵过程.
1材料和方法
1.1试验材料
红鱼、鲽鱼下脚料由烟台裕源水产品公司提供；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.
1.2发酵工艺
红鱼下脚料、鲽鱼下脚料按一定比例混合,加水捣碎,加入一定量的玉米面和麸皮（玉米面、麸皮及下脚料总质量为300g）,水浴30min.加水至600mL,121℃灭菌20min.将活化后的种子培养液（生理盐水调节酵母菌数达107）接种于三角瓶中,摇床110r·min-1发酵培养.
1.3发酵温度确定
按l0%接种量将菌液接种至液体种子培养基中,分别于20,28,30,34,37,50℃,110r·min-1摇床培养24h,以未接种的液体培养基为对照,测定接种的MRS液体培养基在660nm处的OD值,确定枯草芽孢杆菌的最适生长温度[11].
1.4单因素试验
分别进行玉米面量、麸皮量、发酵时间、接种量对发酵产物粗蛋白含量的影响试验.
1.5正交试验设计
以玉米面量、麸皮量、发酵时间及接种量4个因素为变量,设计4因素3水平正交试验,正交试验设计见表1.
1.6检测指标及方法
1.6.1粗蛋白含量测定发酵前后物质的蛋白质含量测定方法按照（GB/T6432—1994）凯氏定氮法进行测定.
1.6.2隆丁法对可溶性蛋白区分测定可溶性蛋白区分测定方法参见参考文献[12].
1.6.3乳酸含量测定取发酵后样品10.00g,加蒸馏水100mL,于摇床上100r·min-1振动30min,3000r·min-1离心5min.取10.00mL上清液,加入40mL蒸馏水,滴加3滴酚酞指示剂,用标定过的0.10mol·L-1氢氧化钠溶液滴定至微红.
1.6.4氨基酸含量测定氨基酸测定采用GB/T18654.11-2008.
2结果与分析
2.1发酵温度优化由图1可知,枯草芽孢杆菌的适应温度范围较广,在28～37℃时OD值均较高,34℃时达到最高点,为枯草芽孢杆菌的最佳发酵温度.
2.2单因素试验结果
2.2.1玉米面量对发酵产物粗蛋白含量的影响在发酵温度34℃、麸皮含量3%、发酵时间2d和接种量6%的条件下,玉米面量分别为1%,3%,5%,7%,9%进行发酵,结果见图2.由图2可以看出,当玉米面量为5%时,发酵产物的粗蛋白含量最高.
2.2.2麸皮量对发酵产物粗蛋白含量的影响在发酵温度34℃、玉米面含量3%、发酵时间2d和接种量6%的条件下,麸皮量分别为1%,3%,5%,7%,9%进行发酵,结果见图3.由图3可以看出,当麸皮含量为3%时,发酵产物的粗蛋白含量最高.
2.2.3发酵时间对发酵产物粗蛋白含量的影响在发酵温度34℃、玉米面含量3%、麸皮含量3%和接种量6%的条件下,发酵时间分别为1,2,3,4,5d进行发酵,结果见图4.由图4可以看出,当发酵时间为2d时,发酵产物的粗蛋白含量最高,可达到66.78%.
2.2.4接种量对发酵产物粗蛋白含量的影响在发酵温度34℃、麸皮含量3%和发酵时间2d的条件下,接种量分别为1%,3%,6%,9%,12%进行发酵,结果见图5.由图5可以看出,当接种量为6%时,发酵产物的粗蛋白含量最高.2.3正交试验结果
在单因素试验的基础上,选择玉米面量、麸皮量、发酵时间、接种量4个因素,每个因素设定3个水平,进行正交试验,结果见表2.
由表2可以看出,玉米面含量是影响枯草芽孢杆菌发酵产物中粗蛋白含量的重要因素.以粗蛋白含量为指标,枯草芽孢杆菌发酵最佳组合为A1B1C2D1,即玉米面量3%,麸皮量1%,发酵时间2d,接种量为3%.在此条件下,粗蛋白含量可达78.44%.枯草芽孢杆菌具芽孢休眠体,生命力旺盛,适应环境能力强,存活率高,因此接种量3%即可达到相对较好的发酵效果.
2.4发酵前后蛋白含量变化
经过正交试验优化发酵条件,枯草芽孢杆菌发酵后蛋白含量均值为64.63%,在最佳发酵条件下,蛋白含量可达74.96%,未发酵原料蛋白含量为63.10%,从这一试验结果可以看出,发酵后蛋白含量有了显著提高（P<0.01）.
2.5发酵前后可溶性氮含量变化
由表4可以看出,与对照组相比,枯草芽孢杆菌发酵后,原料中的可溶性氮含量明显提高,这可能是微生物产生的酶降解了大分子蛋白质的原因.可溶性氮在一定程度上反映消化吸收情况,发酵产物中可溶性氮含量的适量提高使饲料的应用价值得以提升.
2.6氨基酸含量分析
由表5可知,发酵后产物中氨基酸总量均高于国产鱼粉,多数氨基酸含量有不同程度的提高.此外,与国产鱼粉相对比,谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等含量显著增加,产物的鲜味和甜度随之提高；脯氨酸等含量减少,产物的苦味相应降低.结果表明,发酵产物的风味得到不同程度的改善,这与Ing-LungShih等关于微生物发酵鱼类下脚料生产鱼露的报道相类似.
2.7乳酸含量分析
从表6可以看出,经过枯草芽孢杆菌发酵后,发酵产物中乳酸含量有很大程度的提高,将发酵产物添加至饲料,能够有效改善饲料pH值,降低饲料溶失率.
3结论与讨论
菌种发酵的最佳条件：以红鱼、鲽鱼下脚料为主要原料,辅以玉米面和麸皮,进行枯草芽孢杆菌发酵,最佳工艺组合为：玉米面量3%,麸皮量1%,发酵时间2d,接种量为3%,温度34℃.在此条件下,粗蛋白含量可达74.96%；发酵后原料中的可溶性氮含量、乳酸和氨基酸含量都有所提高.
芽孢杆菌是具芽孢的好氧菌,它能产生VB1、VB2、VB6等B族维生素,还能产生VC、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等酶以及多种代谢产物,并可产生有机酸、合成维生素等,对饲料的降解、消化、吸收和动物的营养代谢起到促进作用[14-15].试验结果表明,发酵后下脚料中的中低分子蛋白均有不同程度的提高,氨基酸量也有所改善,这与菌种在发酵过程中产生的相关酶类,降解了原料中的蛋白质,提高了发酵产物中小分子物质含量有关.此外,菌种自身也含有一定量的蛋白质和氨基酸.利用水产动物和植物性蛋白按一定比例混合发酵,可消除植物性蛋白限制性氨基酸对动物的影响,有效平衡氨基酸含量,在某些水产饲料中具有完全替代鱼粉使用的可能性[5].微生物发酵产酶降解下脚料中的蛋白质是一个复杂的过程,而且发酵产物对水产动物的作用机理研究需要进一步深入研究,为发酵动植物蛋白能更加高效和广泛地应用于水产饲料中提供理论依据和指导.