LC―Q―TOF―MSLC―IT―MS酸枣仁汤的化学成分

更新时间:2024-03-12 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:4197 浏览:9666

摘 要 : 采用液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)及液相色谱-离子阱质谱(LC-IT-MS)系统剖析了酸枣仁汤中化学成分.色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18,Rapid Resolution HT(4.6 mm×50 mm,1.8 μm);以乙腈(A)-0.05%甲酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱;流速0.6 mLmin-1;柱温30 ℃.共鉴定了酸枣仁汤中48个化合物,并对化合物的药材来源进行了归属,首次报道了方剂中的31个化合物.LC-Q-TOF-MS结合LC-IT-MS可以简便、快速地对酸枣仁汤中化学成分定性分析,本研究结果为酸枣仁汤质量控制和药效物质基础研究提供了一定的理论依据.

关 键 词 : LC-Q-TOF-MS;LC-IT-MS;酸枣仁汤;化学成分

[收稿日期] 2013-10-10

[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09307-002-01)

[通信作者] *王书芳, 副研究员, Tel:(0571)88208426,E-mail: wang@zju.edu.

[作者简介] 朱云祥,硕士研究生,E-mail: 21319042@zju.edu.

酸枣仁汤出自张仲景的《金匾要略血痹虚劳脉证并治第六》[1],由酸枣仁2 L、茯苓2两、川芎2两、知母2两和甘草1两组成.该方具有养血安神,清热除烦之效.主治发汗后,不得眠睡,或虚劳烦扰,气奔胸中不得眠之症.现代药理学研究发现酸枣仁汤具有镇静催眠、抗抑郁、抗应激、抗焦虑[2-6]等作用,主要用于治疗失眠、抑郁症、躁狂、神经衰弱等[7-8]神经系统类疾病.

目前对酸枣仁汤化学成分研究报道有LC-MS鉴定了27个化合物[9]和液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)鉴定了24个化学成分[10].为了更深入研究酸枣仁汤的化学物质基础,本文采用LC-Q-TOF-MS和高效液相色谱-离子阱质谱(LC-IT-MS)对酸枣仁汤中化学成分进行定性分析.

1.材料

1.1 仪器 LC-IT-MS系统:Agilent1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配二元梯度泵、PDA检测器、柱温箱和自动进样器;Finnigan LCQ-DECA XPPlus离子阱质谱仪(美国Thermo公司),配电喷雾离子源及Xcalibur l.3控制系统;LC-Q-TOF-MS系统:AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(美国Waters 公司);Triple TOF 5600+型飞行时间质谱,配有电喷雾离子源(美国AB SCIEX公司); Eppendorf minispan离心机(德国Eppendorf公司);METTLER TOLEDO XS105分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);Agilent Zorbax SB-C18 Rapid色谱柱(4.6 mm×50 mm,1.8 μm),前置Agilent C18预柱;MilliPore超纯水器(美国Millipore公司).

1.2 试药 酸枣仁(河北,批号120425)、茯苓(安徽,批号120504)、川芎(四川,批号120309)、知母(河北,批号120320)和甘草(新疆,批号120509)药材均购自浙江中医药大学饮片厂.各药材均由浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定.对照品绿原酸(批号130510)、新绿原酸(批号 130426)、隐绿原酸(批号 130405)、牡荆素葡萄糖苷(批号 111227)和芹糖异甘草苷(批号 121125)均购自上海融禾医药科技发展有限公司,酸枣仁苷A(批号 MUST-11042301)、酸枣仁苷B(批号 MUST-11042302)、斯皮诺素(批号 MUST-12011809)、知母皂苷B-Ⅱ(批号 MUST-12010903)、知母皂苷A-Ⅲ(批号 MUST-11042609)、夏佛塔苷(批号 MUST-12061201)和洋川芎内酯A(批号 MUST-12071102)均购自成都曼思特生物科技有限公司,甘草查耳酮A(批号 W07-9-4)购自天津中新药业,纯度均大于98%,芹糖甘草苷、新西兰牡荆苷Ⅱ、芒柄花苷、甘草酸和甘草皂苷G2由实验室制备所得,经1H,13C-NMR鉴定;甲酸(Tedia, Fairfield, USA)、乙腈、甲醇为色谱级(Merck, Darmstadt, Germany),LC所用水为Millipore超纯水,其余所用试剂均为分析纯.

2.方法

2.1 供试品溶液的制备 按照金匮要略中酸枣仁汤各药材配比,准确称取酸枣仁117.7 g、茯苓23.8 g、川芎23.8 g、知母23.7 g和甘草11.9 g,置2 L烧瓶中,加入6倍量水,浸泡12 h后用电热套加热回流1 h,倾出第1次提取液,纱布过滤;药渣中加入4倍量水,再用电热套加热回流1 h,倾出第2次提取液,纱布过滤,合并2次提取液,从中取100 mL,蒸干,用10 mL水溶解,取其中1 mL以10 000 rmin-1转速离心10 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤后供LC-MS分析.准确称取酸枣仁、茯苓、川芎、知母和甘草五味药材各10 g,分别置于5个100 mL 烧瓶中,各加入6倍量水,浸泡12 h后用电热套加热回流1 h,倾出第1次提取液,纱布过滤;药渣中加入4倍量水,再用电热套加热回流1 h,倾出第2次提取液,纱布过滤,合并2次提取液.分别取5种药材提取液2 mL,以10 000 rmin-1转速离心10 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤后供LC-MS分析. 2.2 对照品溶液的制备 取1.2中18个对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成质量浓度为1 gL-1的对照品溶液,供LC-MS分析.

2.3 色谱条件 流动相A-0.05%甲酸水,B-乙腈;线性洗脱梯度(0 min,3%B;35 min,41% B;40 min,100% B;50 min,100% B);流速 0.6 mLmin-1;柱温30 ℃;进样量3 μL;扫描范围190~400 nm,检测波长254,280 nm.

2.4 Finnigan LC-Q-DECA XP Plus质谱条件 扫描范围m/z 100~1 500;碰撞裂解气:高纯氦;离子源电压 +4 kV/-4 kV;毛细管电压 +19 V/-19 V;毛细管温度 350 ℃;套管透镜补偿电压 25 V/-25 V;鞘气和辅助气为氮气, 鞘气流速 60 Lmin-1;辅助气和吹扫气流速 20 Lmin-1.多级质谱采用dependent scan或selected reaction monitoring(SRM) 扫描监测模式分析.采用Thermo Finnigan Xcalibur l.3工作站获取及处理数据.

2.5 AB SCIEX Triple TOF 5600+质谱条件 一级条件:扫描范围m/z 100~1 500;干燥气344 753 Pa;辅助加热气 344 753 Pa;气帘气 206 852 Pa;毛细管温度 550 ℃;离子喷雾空载电压 5 500 V/-4 500 V;去簇电压 100 V/-100 V;碰撞能量 10 V/-10 V.

二级条件:扫描范围m/z 100~1 500;去簇电压 100 V/-100 V;碰撞能量 35 V/-35 V;碰撞能量幅度-19 V;离子释放延迟 67;离子释放宽度 25.

3.结果与讨论

取供试品溶液,按2.3,2.4项下色谱条件进样分析,分别得到酸枣仁汤的正、负离子模式下LC-IT-MS全扫描的Base Peak色谱图,见图1.在正离子模式下,除了准分子离子峰[M+H]+外,有部分化合物显示出丰度很高的加合离子[M+NH3]+;在负离子模式下,准分子离子峰一般为[M-H]-,同时还有部分化合物显示出了高丰度的[M+HCOO]-离子峰.对正、负离子扫描下的准分子离子峰进一步进行了二级、质谱分析.通过LC-Q-TOF-MS获取各个色谱峰对应的准确分子量并计算得到可能分子式,结合LC-IT-MS提供的化合物多级质谱信息及与对照品进行比对,共鉴定和推测了酸枣仁汤中48化合物,见表1,其中6个来自川芎,9个来自知母,11个来自酸枣仁,20个来自甘草,另有2个为酸枣仁和甘草的共有成分.

图1 酸枣仁汤正(A)、负(B)离子模式下的LC-IT-MS全扫描Base Peak色谱图

Fig.1 Base peak chromatogram of Suanzaoren tang by LC-IT-MS in positive (A) and negative (B) ion mode

3.1 黄酮类化合物 共鉴定出17个黄酮及其衍生物,其中包括8个黄酮类化合物,3个二氢黄酮类化合物,2个异黄酮类化合物,1个黄酮醇类化合物,3个查尔酮类化合物.黄酮类化合物的裂解规律已有较多的文献报道[11-13].化合物9~12,14,17,19 表1 酸枣仁汤中鉴定化合物的LC-Q-TOF-MS及LC-IT-MS信息

Table 1 The information of the identified pounds in Suan-zao-ren-tang by LC-Q-TOF-MS and LC-IT-MS

续表1续表1 注:1)方剂中首次鉴定的化合物;2)与对照品对照;3)表示一级质谱为LC-IT-MS数据.

和22经推测分析均为黄酮碳苷,有相似的裂解规律.以化合物10为例,准分子离子峰m/z 563[M-H]-失去18,60,90,120后分别形成碎片离子m/z 545, 503,473,443,且未有丢失162的质谱碎片.m/z 443碎片进一步失去60,90后形成m/z 383,353的碎片离子.m/z 443碎片C环发生开裂,形成0,3A m/z 221和0,4A m/z 191的碎片离子.与对照品对照,峰10鉴定为夏佛塔苷.峰9,12和14与对照品对照分别鉴定为新西兰牡荆苷Ⅱ、牡荆素葡萄糖苷和斯皮诺素.参考化合物10的裂解规律,推测峰11,17,19和22分别为6-(4-O-β-D-glucopyranosyl)vanilloyl spinosin,当药黄素,6-dihydrophaseoylspinosin和6″-阿魏酰斯皮诺素.

化合物13和15有相同的准分子离子峰m/z 549[M-H]-,且在二级质谱碎片中有相同的基峰m/z 255.高分辨质谱数据表明其有相同的分子式C26H30O13,说明这2个化合物为同分异构体.峰15经对照品对照可知其为芹糖甘草苷,故推测化合物13为芹糖甘草苷的异构体,可能碳的连接位置或顺序不同.化合物7 的高分辨质谱数据给出分子式为C27H32O15,其准分子离子峰m/z 595[M-H]-,二级、质谱碎片中有碳苷的常见碎片丢失18,60,90,120,且未见丢失162的碎片.参照文献[14],推测峰7为6,8-di-C-glucosyl-2(S)-naringenin或6,8-di-C-glucosyl-2(R)-naringenin.

化合物25在正离子模式下,准分子离子峰为m/z 431 [M+H]+,该离子失去162后得到母核m/z 269.与对照品比对可知峰25为芒柄花苷.化合物16的分子式为C28H32O15,与化合物14互为同分异构体,且有相似的裂解碎片.故确定峰16为异斯皮诺素. 化合物18在负离子模式下给出m/z 593[M-H]-的准分子离子峰,其二级质谱碎片有m/z 327[M-H-146-120]-和m/z 285 [M-H-146-162]-,m/z 285分别丢失1分子CO和2分子CO及丢失1分子CO后再丢失1分子CO2形成碎片离子m/z 257 [285-CO]-,m/z 229[285-2CO]-和m/z 213 [285-CO-CO2]-.结合高分辨质谱给出的分子式C27H30O15,推测峰18为烟花苷.

化合物24和48经与对照品比对,鉴定为芹糖异甘草苷和甘草查尔酮A.化合物27给出分子式为C16H14O5,参考文献[15]分析其二级、质谱碎片,推测峰27为甘草查尔酮B.

3.2 甾体皂苷类化合物 化合物20,23和26在负离子模式下的准分子离子峰均为m/z 935[M-H]-,高分辨质谱数据显示分子式均为5H76O20,分析3个化合物对应的二级和质谱碎片可知这3个化合物为同分异构体.参考文献[16],推测峰20,23和26分别为timosaponin E1,timosaponin E和timosaponin N.

化合物28和35在负离子模式下准分子离子峰分别为m/z 919[M-H]-和m/z 757[M-H]-,分子式分别为5H76O19和C39H66O14,相差1分子六碳糖C6H10O5(162).化合物28的二级、质谱碎片和化合物35的二级、质谱碎片相似,经对照品比对可知峰28为知母皂苷B-Ⅱ,结合文献[17]可知峰35为anemarrhena saponin Ⅱ 或anemarrhena saponin Ⅰ.

化合物30和47在负离子模式下准分子离子分别为m/z 901 [M-H]-和m/z 739[M-H]-,高分辨质谱给出的分子式分别为5H74O18和C39H64O13,相差C6H10O5(162).由对照品对照确定峰47为知母皂苷A3.化合物30的二级质谱中丢失1分子葡萄糖后形成基峰m/z 739 [M-H-162]-,其质谱碎片和化合物47的二级质谱碎片相似.参考文献数据[17]可知,峰30可能为timosaponin B-Ⅲ或anemarsaponin C或xilingsaponin B.

化合物32和36在负离子模式下的准分子离子峰为m/z 1 205[M-H]-和m/z 1 043[M-H]-,经与对照品对照确定峰32和36分别为酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B.

3.3 三萜皂苷类化合物 化合物38,41和42都给出m/z 821[M-H]-的准分子离子峰,同时高分辨质谱数据拟合出的分子式均为2H62O16,化合物38的保留时间及二级质谱碎片和对照品甘草酸的一致,故确定峰38为甘草酸.化合物38,41和42的二级质谱碎片相似,结合文献数据[18]可知峰41和42分别为licorice saponin H2和licorice saponin K2.化合物29的准分子离子峰和分子式分别为m/z 983[M-H]-和8H72O21.其与甘草酸相差1分子葡萄糖C6H10O5(162),分析化合物29二级及质谱碎片可知峰29为甘草皂苷 A3.

化合物31,33和37有相同的准分子离子峰m/z 837[M-H]-和分子式2H62O17,与对照品甘草皂苷 G2的保留时间和二级质谱碎片进行比对,确定峰33为甘草皂苷 G2.通过分析化合物31和37的二级质谱碎片并参考文献[19-20],暂时推测峰31和37为yunganoside K2或其同分异构体.


化合物34和39的准分子离子为m/z 967[M-H]-,分子式为8H72O20,结合文献[19]及其二级质谱碎片,推测峰34和39为yunganoside J1或yunganoside L1.

化合物40和45高分辨质谱显示有相同的分子式2H64O15,准分子离子峰均为m/z 807[M-H]-,二级质谱均给出碎片m/z 789 [M-H-H2O]-,m/z 771[M-H-2H2O]-,m/z 745 [M-H-CO2-H2O]-,m/z 631 [M-H-176]-,m/z 351 [2×176-H]-和m/z 333 [351-H2O]-,参考文献[18],推测峰40和45为甘草皂苷 B2或其同分异构体.

化合物43和44有相同的准分子离子峰m/z 823[M-H]-和分子式2H64O16.2个化合物均产生碎片m/z 805 [M-H-H2O]-,m/z 761 [M-H-CO2-H2O]-,m/z 647 [M-H-176]- ,m/z 351 [2×176-H]-,m/z 333 [2×176-H-H2O]- ,参考文献[18],推测峰43和44为licorice saponin J2或其同分异构体.

3.4 氧杂蒽酮类化合物 化合物4和6高分辨质谱显示分子式分别为C25H28O16和C19H18O11,相差162,化合物的4的质谱碎片中丢失120后形成的碎片和化合物6的二级、质谱碎片相一致,可知其有相同的母核,分析碎片可知,化合物4和6有碳苷类化合物丢失60,90,120的裂解规律,且无162碎片产生.经推测分析并参考文献[21],峰4和峰6分别鉴定为新芒果苷和芒果苷.

3.5 酚酸类化合物 在负离子模式下,化合物1,3和5均给出准分子离子峰m/z 353[M-H]-,高分辨数据显示其分子式均为C16H18O9,表明他们互为同分异构体.二级质谱中化合物1的基峰为m/z 191,m/z 179的相对丰度为81%;化合物3的基峰为m/z 191且m/z 179的相对丰度仅为9%;化合物5的基峰为m/z 173,m/z 179 和m/z 191的相对丰度分别为97%和18%.上述信息与文献[22-23]报道及对照品的裂解规律一致,且与对照品的保留时间一致.故峰1,3和5分别鉴定为新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸. 化合物2在负离子模式下准分子离子峰为m/z 167[M-H]-,二级和质谱碎片分别给出m/z123,108,表明该分子先丢失1分子CO2后进一步丢失1分子自由基.高分辨质谱显示其分子式为C8H8O4,参考文献[24],峰2鉴定为香草酸.

3.6 其他类化合物 在正离子模式下,化合物8,21和46都有较高的响应,分别给出准分子离子峰m/z 342 [M+H]+,m/z 225 [M+H]+和m/z 193 [M+H]+.高分辨质谱显示化合物8的分子式为C20H23NO4,其二级质谱碎片m/z 311,299和297分别由准分子离子峰失去1分子CH3O,C2H6N和C2H8N后形成.在质谱碎片中m/z 297丢失1分子自由基,生成m/z 282 的碎片,丢失1分子CH3OH后形成m/z 265的碎片.参考文献[25]并结合上述推导过程,推测峰8为木兰花碱.化合物46通过与对照品比对鉴定其为洋川芎内酯A,其特征碎片为m/z 175 [M+H-H2O]+,m/z 147 [M+H-HCOOH]+,m/z 137 [M+H-CO-C2H4]+,m/z 119 [M+H-HCOOH-C2H4]+,m/z 105 [M+H-HCOOH-C3H6]+,m/z 91 [M+H-HCOOH-H8]+.化合物21与化合物46有相似的特征碎片m/z 207 [M+H-H2O]+,m/z 161 [M+H-HCOOH]+,m/z 193 [M+H-CH2]+,m/z 179[M+H-CO]+,m/z 151 [M+H-H8]+,为苯酞内酯类化合物,参考文献[26],推测峰21为洋川芎内酯H.

本研究采用液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)及液相色谱-离子阱质谱(LC-IT-MS)对酸枣仁汤中的化学成分进行定性分析,通过分析质谱碎片、准确分子质量及参考文献数据或与对照品对照,共推测和鉴定了酸枣仁汤中的48个化合物,包括22个皂苷类化合物,17个黄酮类化合物,2个氧杂蒽酮类化合物,4个酚酸类化合物,2个苯肽类化合物,1个生物碱,并对48个化合物的药材来源进行了归属,首次鉴定了酸枣仁汤中的31个化合物.LC-Q-TOF-MS结合LC-IT-MS可以简便、快速地对酸枣仁汤中化学成分定性分析,本研究结果为酸枣仁汤质量控制和药效物质基础研究提供了一定的理论依据.

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ZHU Yun-xiang, CHEN Lu-lin, GONG Jing-ru, WANG Shu-fang(Pharmaceutical Informatics Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

[Abstract] LC-Q-TOF-MS and LC-IT-MS in positive and negative ion mode were applied to simultaneously characterize the constituents in Suanzaoren tang. Analysis was performed on an Agilent Zorbax SB-C18, Rapid Resolution HT column(4.6 mm×50 mm,1.8 μm) with gradient elution of acetonitrile(A)-aqueous solution containing 0.05% formic acid(B) at a flow rate of 0.6 mLmin-1 and the column temperature was 30 ℃. By paring MS fragmentation, accurate molecular weight, literature date and standard pounds information, a total of 48 pounds were succesully identified or speculated. The origins of these pounds were assigned to the corresponding Chinese medicine. Thirty-one pounds were reported in Suanzaoren tang for the first time. LC-Q-TOF-MS bined with LC-IT-MS is a simple and rapid tool for the identification of constituents of Suanzaoren tang, and the results could provide evidence for the research on quality bined and effective constituents of Suanzaoren tang.

[Key words] LC-Q-TOF-MS; LC-IT-MS; Suanzaoren tang; chemical costituents

doi:10.4268/cjcmm20140319

[责任编辑 孔晶晶]

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