本站原创摘 要：PEP羧化酶是植物和CAM植物光合碳代谢的关键酶,催化PEP与CO2形成草酰乙酸.在植物生理研究中,常需要测定其活性.但是传统的测定方法,时间长、费用高.本文介绍一种简便且费用低的测定玉米叶片PEP羧化酶活性的方法,以期为其他研究者提供参考.
关 键 词 ：玉米；PEP羧化酶；酶活性
中图分类号：Q946 文献标识码：A
PEP羧化酶是植物和CAM植物光合碳代谢的关键酶,催化PEP与CO2形成草酰乙酸.PEP羧化酶不但在光合碳代谢中的起着重要作用同时也与其他代谢途径相偶联,如氮代谢、水分代谢等.因此在植物生理研究中,常需要测定其活性.但是传统的测定方法,时间长、费用高,不适合大规模试验研究.本文笔者在玉米碳氮代谢相关基因QTL定位的研究过程中,为了在较少时间内完成大量试验材料的测定,在参考前人的方法基础上,摸索出一种简便且费用低的测定玉米叶片PEP羧化酶活性的方法,以期为其他研究者提供参考.
1.材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
利用玉米（Zea mays L.）自交系沈3336、沈3265构建的F2：3代作图群体,取其中6份材料的灌浆期穗位叶,每份取5株,去叶脉,取中部,3次重复.
1.1.2 试剂
提取缓冲液（100mmol·L-1Tris-HCl缓冲液,pH8.2,内含7mmol·L-1巯基乙醇,1mmol·L-1EDTA,5%甘油）；酶反应缓冲液（100mmol·L-1Tris-HCl缓冲液,pH9.2）；10mmol·L-1MgCl2；10mmol·L-1NaHCO3；1g·L-1NADH；苹果酸脱氢酶（1300u/mL）；40mmol·L-1PEP.
1.1.3 仪器
离心机；分光光度计；水浴锅.
1.2 方法
1.2.1 PEP羧化酶的提取
将0.5g叶片放入预冷的研钵中,加入少量石英砂,加入4mL预冷的提取缓冲液,迅速研磨,于4℃下15000r/min离心20min,取上清液备用.
1.2.2 酶活性测定
反应液总体积3.0mL,内含1mL酶反应缓冲液,100uL酶液,100uL10mmol·L-1MgCl2,100uL10mmol·L-1NaHCO3,300uL 1g·L-1NADH,10uL苹果酸脱氢酶,1190uL蒸馏水,于28℃水浴10min,在340nm处测定光密度（OD1）,再加入200ul 40mmol·L-1PEP启动反应,立即计时,记录1min后光密度值（OD2）.设置对照（CK）,对照反应液除用100uL提取缓冲液代替酶液和最后加入200uL蒸馏水代替200uL 40mmol·L-1PEP外,其他成分与反应液一致.
1.2.3 酶活计算
3.讨论
马力耕等认为反应系统的pH值在9.0左右时,可用粗酶提取液测定活性,为了节省时间、费用,我们采用pH值为9.2的反应体系,用酶的粗提液代替纯化酶,省略了纯化步骤.另外,在观测大量样本时,如需要进行酶活性的相对比较时,可以省略复杂酶活力计算,用单位时间内消光值变化表示酶活性.值得一提的是,目前文献中都没有提及稀释作用的影响,实验结果表明,对于稀释作用的影响应该给予考虑.
4.结论
综上所述,该方法省略提纯步骤,在提高效率的同时节约成本,适用于大量样本测定.本文提出稀释作用的影响,这是现有方法中从未提到过的,希望能为其他研究者提供参考.