本站原创摘 要 ：上世纪80年代中期,分子生物学领域诞生了一项新技术,称作DNA体外扩增法,简称为PCR技术.该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点,自诞生之日起,其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证.本文重点介绍一下PCR技术在食品检验中的应用.
关 键 词 ：PCR 原理与技术 食品检验 应用
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0038-01
1.引言
上世纪80年代中期,分子生物学领域诞生了一项新技术,称作DNA体外扩增法,简称为PCR技术.其基本原理是在生物体的体外,对指定DNA双链片断进行扩增.第一步：挑选出指定DNA双链片断,人工合成指定DNA双链片断端头邻近序列互补的寡核苷酸片断,将该互补片段称作引物（Primer）,引物也是双链结构,分作左端引物和右端引物.第二步：加热指定DNA双链片断,使之发生变性,分裂成单链,把左右引物与之分别配对进行互补结合.第三步：在DNA聚合酶和4种dNTPs底物的共同作用下,引物沿模板DNA链按5/→3/方向延伸,合成DNA双链,这个步骤被称为DNA多聚酶链反应.第四步：以新合成的DNA双链作为扩增模板,重复DNA多聚酶链反应步骤.历经25～35次循环,可将DNA序列扩增到近百万倍.该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点,自诞生之日起,其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证.
2.PCR技术在食品检测方面的应用
2.1 PCR技术的检测原理
PCR技术最根本的鉴定依据是生物的DNA结构具有唯一性.在食品检测中,起到鉴定标准模板作用的是引物,从理论上说,①如果引物来自DNA保守区,则在扩增之后,所有被检测对象都含有DNA保守区的片段；②如果引物来自DNA特异区,则在扩增之后,所有被检测对象都含有DNA特异区的片段.以上两种理论依据就是PCR技术的检测原理.
在实际应用中,人工有选择地截取DN段,使用DNA多聚酶链反应,可以在2～3小时之内达到常规检测需要数天才能达到的培养效果,另外还省去了繁琐的种属鉴定等工作,简化了检测流程.
2.2 PCR技术的操作程序
（1）待检样品的浓集（增菌）.食品中待检的微生物群落浓度一般都是比较低的,达不到检测要求.这就需要进行待检微生物的浓集.
（2）核酸的提取.为了实现PCR扩增,必须提取待检样品的核酸.常用的处理方法包括：加热、反复冻融、化学裂解.
（3）PCR扩增.在扩增过程中,最关键的莫过于引物,它直接关系到PCR检测的成败.扩增需要20―40个反应循环,每个循环都由高温变性、低温退火、适温延伸组成.高温时,氢键打开,双链变为单链,生成扩增模板；低温时,左引物和右引物分别与模板DNA的2条单链做互补结合,完成配对；适温时,在聚合酶作用下,4种三磷酸脱氧核苷（A、T、G、C）按碱基互补配对原则不断进行配对添加,按5/→3/方向自动合成新的DNA双链片段.
变性温度一般需保持在94℃左右,如果待扩增区域DNA的G+C含量太高,则可考虑适当提高变性温度.
退火温度与引物的G+C含量有关,根据公式：Ta等于4×（G+C）+2×（A+T）-5.
延伸温度一般需保持在72℃左右,此时DNA聚合酶的聚合速度约1000（碱基）/min.
（4）扩增产物的检测.常用的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法,琼脂糖质量分数在0.8%～2%之间.待分离DN断的分子量越小,所需琼脂糖质量分数则越大,反之亦然.
3.PCR技术用于食品检测的优缺点
3.1 PCR技术的优点
传统检测方法多采用平板培养法,通过菌落计数来判断菌体浓度.传统方法的优点是操作简单,其最大的缺点是消耗的时间太长,检测周期一般在3――10天.
PCR技术的最大优点就是检测速度快,使用特异区扩增检测,只要在几个小时内成功扩增,即可检验并判断出待检测样品的种类,非常迅捷、灵敏.
3.2 PCR技术的缺点
任何事物都不是完美的,PCR技术一样存在缺点,正是这些缺点的存在,导致其不能完全取代传统检测法.其主要缺点包括：（1）检测阳性问题.核酸受到污染而造成检测阳性的问题,是PCR技术的最大缺点.这个缺点来自扩增本身,在扩增的过程中,即使只有一个污染源,结果也会出现成十万成百万倍的污染现象,造成检测结果出现阳性,称之为检测阳性.
防止检测阳性问题,目前只有做好隔离这一种办法.（2）检测阴性问题.检测阳性问题来自PCR技术本身,检测阴性问题则来自待测样品.食品成分复杂,其中多种成分发生了复杂的化学反应,不能排除模板液中带有某种或某些抑制PCR反应的成分.防止检测阴性问题的办法是设置阳性对照环节.（3）定量检测困难.由于影响PCR产率的原因比较多,在定量检测方面不能提供较为精准的数据,导致PCR技术无法胜任定量检测.直至目前,尚没有实质性的突破与进展,限制了PCR技术在检测方面的应用范围.
4.结论
PCR检测有一定的局限性,但是,其高灵敏度的检测反应、明显的特异性辨别、快速简便的检测流程,是其它检测方法所不能替代的.相信随着生物技术的快速进步,PCR检测技术的应用范围会越来越广泛.