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组学与分析技术课程论文
论文题目:蛋白质组学分析技术在研究棉铃虫Bt抗性中的应用
课程名称:蛋白质组学与分析技术
学期:2016-2016学年度第一学期
班级:13级硕士8班
学号:82101132313
姓名:袁向东
2016年4月 目录
一、Bt结构和功能2
二、Bt毒素的作用机制3
2.1穿孔检测设模型:3
2.2信号转导检测设模型4
2.3渗透溶解和信号转导共同作用检测设模型4
三,运用蛋白质组学分析技术研究棉铃虫对Bt蛋白产生抗性的原因5
3.1材料与方法6
3.1.1抗性品系筛选6
3.1.2棉铃虫中肠总蛋白的制备6
3.1.3双向电泳分离蛋白6
3.1.4分析敏感棉铃虫和抗性棉铃虫中肠上调和下调蛋白6
3.1.5蛋白质显着性富集分析,归纳中肠上皮细胞同类受体的表达情况7
3.1.6WesternBlot分析验证7
3.1.7分析与之其反应的蛋白点7
3.2分析抗性产生的原因7
3.2.1确定Cry1Ac与受体是否结合7
3.2.2受体蛋白的表达量下调7
3.2.3结合位点的改变8
3.2.3凝胶蛋白阻滞8
3.2.4观察受体与蛋白结晶的结合部位8
致谢10
蛋白质组学分析技术在研究棉铃虫Bt抗性中的应用
摘 要:目前棉苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是目前产量最大,使用最广的生物杀虫剂.它的主要活性成分是在其形成芽孢的过程中产生的具有杀虫活性的伴孢晶体,又称杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)或δ-内毒素,对鳞翅目,鞘翅目,双翅目,膜翅目,同翅目等昆虫,以及动植物线虫,蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性,同时对害虫天敌和高等动物无毒性,世界上应用最为广泛,用量最大,效果最好的微生物杀虫剂.
苏云金芽孢杆菌由日本细菌学家石渡和德国科学家恩斯特·贝尔林纳(ErnstBerliner)分别在1901年和1911年独立发现.贝尔林纳是从患有叫Schlaffsucht的疾病的地中海粉蛾幼虫中发现该菌,并用发现地德国图林根命名.苏云金芽孢杆菌的应用始于欧洲的一个实验室,人们利用小型发酵装置生产出Bt芽孢和晶体混合物,目的是用于防治欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis).1981年,Schnepf和Whiteley首次从库斯塔克亚种(Btsubs.kurstaki)HD-1菌株中成功的克隆出第一个编码Bt杀虫蛋白的基因,并将其转入大肠杆菌Escherichiacoli(E.Coli)中表达,发现表达后的杀虫晶体蛋白对烟草天蛾Manducasexta幼虫具有很高的毒杀作用.1988年Monsanto公司将外源Bt杀虫晶体蛋白导入棉花,并获得良好的抗虫性.1998年,在无脊椎病理学会年会上成立的由Crickmore为委员的委员会更新了Cry内毒素的命名法,新的命名法以杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一标准,将杀虫晶体蛋白分成四个等级:杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性小于45%定为第一等级,即Cry1和Cry2之间,用阿拉伯数字表示,同源性在45%-78%之间定为第二等级,即Cry1A和Cry1B之间,用大写英文字母表示,同源性在78%-95%之间定为第三等级,即Cry1Aa和Cry1Ab之间,用小写英文字母表示,同源性在95%以上定为第四等级,即Cry1Aa1和Cry1Aa2之间,用阿拉伯数字表示.,Cry毒素的3D结构已经弄清楚,:Cry1Aa,Cry1Ac,Cry2Aa,Cry3Aa,Cry3Ba,Cry3Bb,Cry4Aa,Cry4BaCry8Ea.
Bt毒素一般含有三个结构域:结构域Ⅰ(domainⅠ,DⅠ),结构域Ⅱ(domainⅡ,DⅡ),结构域Ⅲ(domainⅢ,DⅢ),每一个结构域的生物学功能不同.其中,Ⅰ有七个α螺旋缠绕而成,在膜的插入,毒素寡聚化和孔洞形成中有重要的作用.结构域Ⅱ是三个反平行的β-折叠片层呈β-三棱柱(beta-pri)围成一个疏水核心,与受体识别有关.结构域Ⅲ是两个反向平行的β-折叠组成的β-三明治(β-sandwich)夹心结构.结构域Ⅱ和Ⅲ通过在不同的昆虫中肠蛋白中调节特异的互作具有重要的作用.第三个空间结构是保守的,说明Cry-3D家族具有相似的作用机制机制,即使它们的氨基酸序列的同源性很低.2+的信号转导途径,从而导致细胞程序性死亡.事实上毒素发挥作用要比检测定的细胞穿孔模型复杂得多,毒素发挥作用是一个复杂的动态过程.在细胞与毒素之间存在着两种相互作用,第一种是磷脂与毒素之间的作用,毒素经寡聚化后插入膜内,但在膜上没有形成孔道,细胞并不发生毒素反应,第二种是毒素与Cadherin受体特异性结合后,激发了依赖Mg2+
的信号转导途径的下游反应,导致细胞程序性死亡.在后续实验中发现受体结合的信号传导途径通过刺激G蛋白,腺嘌呤环化酶(AC)的活力,提高腺苷酸环化酶(cAMP)的活性,腺苷酸环化酶进一步激活蛋白激酶A,然后引发一系列的细胞变化,包括:细胞骨架重排及离子稀释等,之后由于细胞化学性质的改变导致死亡.
2.3渗透溶解和信号转导共同作用检测设模型
此模型是以Cry1Ac作用于烟芽夜蛾的实验中得出并结合以上提到的两个模型而提出的.该模型认为,活化的Cry1Ac单体与类钙粘蛋白HevCaLP结合,激活了细胞内受磷酸酶调控的信号传导途径,该信号转导途径还依赖于肌动蛋白同Cry1Ac毒素的直接相互作用,活化Cry1Ac与HevCaLP结合后,促使Cry1Ac单体寡聚化,寡聚体与脂膜筏内GPI锚定的APN和ALP结合后,使得Cry1Ac毒素在脂筏膜区上聚集,在膜上形成孔洞,导致离子失衡,激活了信号转导途径,最终导致细胞程序性死亡.
三,运用蛋白质组学分析技术研究棉铃虫对Bt蛋白产生抗性的原因(见下图1)
图1应用蛋白质组学预实验流程图
3.1材料与方法
3.1.1抗性品系筛选
敏感品系(96S):1996年采自河南新乡棉田,在室内用人工饲料饲养至今,从未接触过任何杀虫剂.
抗性品系(RtR120):用MVPII(含有20%的Cry1Ac前毒素)连续筛选90代.
饲养条件:温度27+2℃,相对湿度75+10%,光周期14L:10D.
3.1.2棉铃虫中肠总蛋白的制备
取棉铃虫五龄幼虫中肠去除食物和围食膜,用冰冷的0.7%nac冲洗三次,滤纸吸干,称重,置于-80℃保存.加入9倍中肠体积的bufferA于中肠中,用玻璃匀浆器充分匀浆,每匀浆一分钟置于冰上冷却一分钟,如此重复至完全均匀,向匀浆液中加入等体积的bufferB于冰上静止15min后2500g,4℃离心15min,收集上清30000g,4℃离心30min,沉淀用等体积的bufferC悬浮,-80℃冰箱保存.
3.1.3双向电泳分离蛋白
根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离,在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离.二维电泳分离后的蛋白质点经显色,通过图象扫描存档,最后是呈现出来的是二维方向排列的,呈漫天星状的小原点.
3.1.4分析敏感棉铃虫和抗性棉铃虫中肠上调和下调蛋白
通过比较敏感棉铃虫和抗性棉铃虫的双向电泳的同位蛋白变化,找出上调和下调的功能蛋白.
3.1.4.1将双向电泳胶上的蛋白转膜到PVDF膜
a.Edman降解法
先将2-D电泳上的蛋白转膜到PVDF膜上,这样做的目的是减少蛋白量的损失,接着进行Edman降解法测定变化氨基酸的序列.
b.质谱分析
通过高效液相色谱将酶解后的肽端分离,在用质谱分析:其一,分析酶的种类,其二,分析受体蛋白的种类.
3.1.5蛋白质显着性富集分析,归纳中肠上皮细胞同类受体的表达情况
第一,分析富集蛋白的特性和类别,找到功能相似的蛋白群.
第二,分析表达的差异蛋白质,研究其表达的情况和抗性的关系.
3.1.6WesternBlot分析验证
a.将2D电泳的所有蛋白分析后进行转膜
b.用活化的Cry1Ac与之结合
c.用抗Cry1Ac的一抗
d.用羊抗兔做为二抗
或者
a.将2D电泳的所有蛋白分析后进行转膜
b.用含有His标签的Cry1Ac蛋白进行温浴.
c.用抗His的蛋白做一抗
d.用羊抗兔做为二抗
3.1.7分析与之其反应的蛋白点
包括已知的APN等以及各种酶,解毒酶.未知的Cry1Ac受体推测与已知同类是否是类似的受体.
3.2分析抗性产生的原因
3.2.1确定Cry1Ac与受体是否结合
a.可以用免疫电镜进行检测
b.爪蟾卵母细胞表达和双电极电压钳实验技术
3.2.2受体蛋白的表达量下调
受体蛋白的表达量下调,可能是编码该蛋白的基因的启动子区缺失,导致转录因子无法与之结合,从而导致表达量下降.可以通过凝胶阻滞实验来验证该区域的核酸是否发生突变.
3.2.3结合位点的改变
受体结合位点的改变将导致与Cry1Ac的结合能力下降,从而导致抗性的产生,有以下几种研究蛋白互作的方法.
a.酵母双杂交
b.免疫共沉淀
c.双分子荧光互补
d.噬菌体展示技术
e.pull-down技术
f.Far-Western技术
g.蛋白质芯片
h.荧光共振能量会转移
我的实验打算用酵母双杂交和双分子荧光互补来研究蛋白质之间的关系.由于酵母双杂交需要建库比较麻烦,我更倾向于后者双分子荧光互补.
3.2.4凝胶蛋白阻滞
我想蛋白质既然和核酸能相互作用,从而在琼脂糖凝胶电泳上显现出来,结合蛋白的核酸要比未结合蛋白的核酸跑的慢,即显示的分子量较大.同样如果两个蛋白发生相互作用结合到一起,其分子量比他们其中的任何一个都要大,然后做个琼脂糖凝胶电泳,就可以观察到这两个蛋白是否发生相互作用.如果是敏感棉铃虫则受体未发生突变,就能和活化的Bt蛋白发生结合,而抗性棉铃虫由于受体突变,就不能和Bt蛋白质发生结合,分别温浴后做聚丙烯酰胺凝胶电泳,就可以知道是否发生了结合.
3.2.5观察受体与蛋白结晶的结合部位
3.2.5.1X光衍射法
X光衍射具有分辨率高,普遍性高,没有分子量限制,收集数据块,可以自动化,并且可以找出膜蛋白晶体.
3.2.5.2核磁共振法
该方法不需要晶体结晶,精度高,动态结构,接近生理条件下研究蛋白质的相互作用,特别适合研究低亲和力额瞬态复合物.但是有一定的缺点,就是必须用同位素标记,数据处理复杂,目前最大分析30KD260个残基.要求蛋白质不聚合,折叠良好,蛋白质浓度高,但没有X射线衍射分辨率高.
致谢
在上蛋白质组学与分析技术这门课过程中,让我学到了很多实验技术,为我将来的实验打下了坚实的基础.邱老师治学严谨,学识渊博,思想深邃,他对学科前沿敏锐的洞察力以及富于创新和对工作全身心投入的忘我精神,对我产生了很深的影响,是我毕生效仿的榜样.尤其是邱老师的讲课风格,风趣幽默,而且每节课抽出10多分钟的时间进行互动,让我们在轻松愉快的氛围中牢牢掌握所学知识.听了邱老师的课,真的让我受益匪浅,醍醐灌顶.最后再次祝愿邱老师身体健康,工作顺利,阖家欢乐.
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