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学校编号10394图书分类号

学号20161100密级

全日制学术型研究生硕士学位论文

番茄青枯病植物疫苗构建及其免疫抗病机理研究omatobacterialwiltplantsvaccinbuildingandimmunologicmechani

张文州学科专业:微生物学

研究方向:植物病害防治

指导教师:黄建忠教授,刘波研究员

申请学位级别:理学硕士论文提交日期:年月日

论文评阅人:

论文答辩日期:年月日

答辩委员会主席:

学位授予单位:福建师范大学

学位授予日期:年月日年月 中文摘 要

番茄青枯病植物疫苗番茄青枯病植物疫苗免疫抗病机理作植物疫苗.工程菌FJAT-1458同时接种工程菌FJAT-1458和菌株FJAT-91,,工程菌FJAT-14583d,6d再接种菌株FJAT-91,番茄青枯病的发病率较高.

2,植物疫苗工程菌FJAT-1458植物疫苗FJAT-1458胁迫接种对番茄植株株高,根系长度,根系干重影响不显着(P>,0.05),但对番茄植株不同部位的抗氧化酶影响较明显.植物疫苗FJAT-1458胁迫接种能导致番茄植株不同器官的POD,PPO和SOD酶活性总和显着高于对照植株,并且在胁迫处理植株与对照植株之间,POD,PPO和SOD的活性变化动态也有所不同.接种植物疫苗FJAT-1458能改变根系土壤微生物种群结构和含量,FJAT-1458胁迫,不同作物根系土壤微生物总量均比对照组高进一步分析表明,接种FJAT-1458菌株能改变根系土壤微生物群落结构,促进细菌和真菌的生长,抑制放线菌的生长.丝瓜芹菜Simpson指数茄子辣椒Simpson指数番茄芹菜Shannon指数茄子,辣椒丝瓜Shannon指数Pielou指数值

关 键 词:植物疫苗,定殖,防御酶系统,土壤微生物,根系提取液Abstract

Thestudyexpoundedtheimmuneresistancemechanifromreproductivecharacteristics,inducingphysiologicalmechaniofimmunediseaseresistanceoftomatobacterialwiltplantvaccineandmicrobialpopulationstructurechangesofplantrhizospheresoil.Mainfindingswereaollows:

1,ThestudymadepathogenicitytestandcontrolefficacyevaluationtothedifferentpathogenicRalstoniasolanacearumfromthelaboratorysed,strain(FJAT-1458)waoundusedasaplantvaccineengineeringbacteriafromthem,whichhadthebestcontrolefficacy,largecolonization,longcyclecolonizationandbiologicalcharacteristicssTab..Theresultsshowedthat,thedeeperFJAT-1458vaccinationconcentrationsthelowermorbidityoftomatobacterialwilt.WheninoculatingthestrainsofFJAT-1458andFJAT-91atthesametime,themorbidityoftomatobacterialwiltwasthelowest.WhilestrainsFJAT-1458atthefirst,theninoculatingFJAT-91strainsat3dand6dintervally,themorbiditywashigher.

2,PlantvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458couldnotcolonizedintheleafbladeofplantbutthesoil,rootsandstemoftomatorhizospheresoil.AccordingtothedifferentvaccinationconcentrationofplantvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458,thecolonizationcontentwasdifferentintomatoplantandrhizospheresoil,whenvaccinationconcentrationwasthehigher,thecolonizationcontentwaoreandthecolonizationtimewaslonger.

3,TheresultsshowedthattherootlengthanddryweightandtheplantheightoftomatowerenotobviouslyaffectedbyplantvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458(P>,0.05),buttheactivitiesofantioxidantenzymesweresignificantlyaffected.ThetotalactivitiesofPOD,PPOandSODatdifferentpartsoftomatoplantintreatmentweresignificantlyhigherthanincontrol.Moreover,theactivitydynamicsofPOD,PPOandSODwerealsosignificantlydifferentbetweentreatmentandcontrol.

4,AccordingtovaccinatingplantvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458,themicrobialpopulationstructureandcontentofsoilinrootwerechanged.AftertreatmentingbystrainsFJAT-1458,themicrobialtotalcontentofdifferentcroprootsoilswerehigherthanincontrol,andthegroupschangingofPLFAscouldbedividedintodecliningtype,unchangingtype,increasingtype.ThestatisticalanalysisshowedthattheinoculationofFJAT-1458couldchangethemicrobialmunitystructureinthedifferentcroprhizospheresoilduetoimprovingthegrowthofbacteriaandfungiandinhibitingthereproductionofactinomycetes.TheplantvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458treatmentingcouldimprovetheSimpsonexponentvalueoftowelgourd,tomatoes,celeryrhizospheresoil,reducingSimpsonexponentvalueoftheeggplantandchilirhizospheresoil,AndwhichalsocouldimproveShannonexponentvalueofthetomatoesandceleryrhizospheresoil,reducingShannonexponentvalueoftheeggplant,peppersandtowelgourdrhizospheresoil,FJAT-1458couldreducePielouexponentvalueofthese5kindsofcroprhizospheresoil.

5,DifferentrhizosphereextractshadthedifferenteffectoftheplantsvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458growthability.Therhizosphereextractsoftomato,pepperanddwarfbananacouldpromotestrainFJAT-1458growthing,whiletheleekrhizosphereextractsinhibitedstrainFJAT-1458growthing.Throughspectroscopyscanninganalysisshowedthat,afertreatmenting32hoursofrhizosphereextractrompepperanddwarfbanana,nucleicacidandproteincharacteristicabsorptionpeakin260nmand280nmplacewerefailedtofind,whileaabsorptionshoulderpeakwaoundinthe250-300nmsectionoftomatoeandleek.TheresultsshowedthatthecolonymorphologyandattenuationindexofplantsvaccineengineeringbacteriaFJAT-1458werenotobviouslydifferentbydifferentrhizosphereextracts.

Keywords:plantvaccine,colonization,protectiveenzymessystem,soilmicroani,rhizosphereextract

中文文摘

细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌引起的病害,该菌寄主广,54个科的450余种物,严重影响了多重要经济作物,对农业造成重大的经济损失.近年来广泛受到植物病研究者的重视.

无致病力青枯雷尔氏菌诱导植株产生抗性达到免疫保护作用方面的研究相对较少.无致病力青枯雷尔氏菌诱导植株抗病机制研究,对了解病原菌与植株的互作方式,阐明植株系统性获得抗性的机制,提高青枯病生物防治水平等均具有重要的理论和现实意义.番茄青枯病植物疫苗番茄青枯病植物疫苗免疫抗病机理作植物疫苗.不同接菌浓度1×108,1×107,1×106,1×105,1×104cfu/mL番茄青枯病生防效果的影响番茄青枯病生防效果的影响最佳浓度和最佳时间,为青枯病植物疫苗的.工程菌FJAT-1458当工程菌FJAT-1458浓度小于1×106cfu/mL时,番茄青枯病的,1×108cfu/mL时,番茄青枯病的.,同时接种工程菌FJAT-1458和菌株FJAT-91,,工程菌FJAT-14583d,6d再接种菌株FJAT-91,番茄青枯病的发病率较高,致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91处理25d后发病率分别为85%,90%,100%.

2,判断筛选的生防菌株生防能力如何,最重要的是其能否在寄主植物根围及植株体内定殖.104,106,108cfu/mL)植物疫苗工程菌FJAT-14582-3和5-6叶期疫苗工程菌FJAT-1458cfu/mL,其在番茄植株体内的定殖时间只有12d,且只在植株根部定殖,在茎和叶均无定殖.当植物疫苗工程菌FJAT-1458接种浓度为106cfu/mL和108cfu/mL时,其在番茄植株体内的定殖时间可达18d.(3)当接种浓度为106cfu/mL时,接种的番茄植株苗龄越小,工程菌FJAT-1458在番茄植株及根系土壤的定殖量越大.

3,本研究以疫苗工程菌FJAT-1458作为外源微生物胁迫接种番茄植株,接种后于不同时间取样分析番茄植株株高,根系长度,根系干重及植株不同器官(根,茎,叶)的防御酶系SOD(superoxidediutase),POD(peroxidase),PPO(polyphenoloxidase)活性动态变化.结果表明,疫苗FJAT-1458胁迫接种对番茄植株株高,根系长度,根系干重影响不显着(P>,0.05),但对番茄植株不同部位的抗氧化酶影响较明显.疫苗FJAT-1458胁迫接种能导致番茄植株不同器官的POD,PPO和SOD酶活性总和显着高于对照植株,并且在胁迫处理植株与对照植株之间,POD,PPO和SOD的活性变化动态也有所不同.这说明,疫苗FJAT-1458的接种可提高植株对病原物入侵的防御能力.

青枯病发生与植株根系土壤微生物群落结构关系密切,引入磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记分析疫苗工程菌FJAT-1458胁迫对不同作物辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根系土壤微生物群落结构的影响,从生态学角度揭示免疫抗的机理,为青枯疫苗的研发提供理论依据.研究胁迫茄子,辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根际土壤胁迫茄子,番茄,芹菜根系土壤微生物PLFAs组成16:0含量最大达到398.14%该标记指示检测单胞菌辣椒,丝瓜根系土壤微生物PLFAs组成19:0含量最大达到294.43%该标记指示细菌番茄根系土壤a11:0,i18:1H,i12:03OH,i19:1I,i16:1G,i14:03OH,17:03OH,18:1ω6c等脂肪酸标记,10Me17:0和10Me18:0,这两个标记在茄子,辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根际土壤平均含量增加胁迫茄子,辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根际土壤PLFAs总量能够促进作物根系土壤细菌和真菌的生长,而抑制放线菌的生长胁迫茄子,辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根际土壤丝瓜芹菜Simpson指数茄子辣椒Simpson指数番茄芹菜指数茄子,辣椒丝瓜指数Pielou指数值植株本番茄,辣椒,粉蕉韭菜根系提取液植物疫苗工程菌FJAT-1458不同根际提取液对植物疫苗工程菌FJAT-1458的.番茄,辣椒,粉蕉的根提取液对工程菌FJAT-1458有促进作用,而韭菜对工程菌FJAT-1458抑制.光谱扫描分析表明这可能和发酵液组分中蛋白质的含量较低有关番茄和韭菜处理液在250-300nm区段有一吸收肩峰.观察发现不同根系处理液处理下菌株的菌落形态和弱化指数菌均无出现显差异.

和致病力菌株来自植株,对环境安全,筛选无致病青枯雷尔氏菌作为植物疫苗防治青枯病是青枯病生物防治的重要内容,对作物具有较好的防效,具有一定的生防潜能.随着现代生物科技的发展以及各学科之间的相互借鉴和渗透,相信在不久的将来即可研制出能在田间对作为青枯病有长期控制的效果的植物疫苗.今后将在青枯病免疫抗病机理的研究及茄科作物青枯免疫接种剂的研究与应用做更深入的探索.

目录

I

AbstractIII

中文文摘V

第一章引言-1-

1.1番茄青枯病及其生物防治研究-1-

1.1.1番茄青枯病病原菌的致病力分化-1-

1.1.2番茄青枯病的致病机理-2-

1.1.3番茄青枯病的生防途径-2-

1.2番茄青枯病生物防治机制的研究-4-

1.2.1生防菌定殖的研究进展-4-

1.2.2生防菌对植株防御酶系统的研究进展-5-

1.2.3生防菌定殖土壤微生态的研究-5-

1.2.4根系提取液对生防菌的研究-6-

1.3番茄青枯病植物疫苗研究及其应用前景-6-

1.4本研究的目的及意义-7-

第二章番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选-9-

2.1引言-9-

2.2试验材料-9-

2.3试验方法-10-

2.3.1番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选-10-

2.3.2番茄青枯病植物疫苗工程菌的接种浓度对番茄青枯病防效的影响-10-

2.3.3番茄青枯病植物疫苗的接种时间对番茄青枯病防效的影响-11-

2.3.4番茄青枯病植株病原菌的的分离及鉴定-11-

2.3试验结果-12-

2.3.1番茄青枯病植物疫苗菌株的筛选-12-

2.3.2番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458的接种浓度对番茄青枯病防效的影响-14-

2.2.3番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458的接种时间对番茄青枯病防效的影响-15-

2.3.4试验获得番茄青枯病植株病原菌的的鉴定-16-

2.4讨论-17-

第三章植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株的定殖特性-18-

3.1引言-18-

3.2试验材料-18-

3.2.1供试菌株-18-

3.2.2培养基-18-

3.2.3供试番茄-18-

3.3试验方法-18-

3.3.1菌液的制备-18-

3.3.2植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖数量-19-

3.3.3植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖数量比较-19-

3.3.4土壤青枯雷尔氏菌的分离-19-

3.3.5植株体内青枯雷尔氏菌的分离-19-

3.3.6植株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定-20-

3.4结果与分析-20-

3.4.1植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖数量-20-

3.4.2植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖数量比较-21-

3.4.3植株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定-23-

3.5讨论-25-

第四章植物疫苗对番茄青枯病免疫抗病的生理机制-27-

4.1引言-27-

4.2试验材料-27-

4.2.1供试菌株-27-

4.2.2培养基-27-

4.2.3供试番茄-27-

4.3试验方法-27-

4.3.1植物疫苗工程菌FJAT-1458胁迫接种和取样方法-27-

4.3.2生物指标测定-28-

4.3.3酶活性的测定-28-

4.3.4数据统计分析-28-

4.4结果与分析-28-

4.4.1植物疫苗胁迫对番茄植株生长的影响-28-

4.4.2植物疫苗胁迫对番茄植株抗氧化酶系活性的影响-29-

4.5讨论-33-

第五章植物疫苗工程菌对不同作物根际土壤微生物群落结构的影响-35-

5.1引言-35-

5.2材料与方法-35-

5.2.1供试材料-35-

5.2.2试验方法-36-

5.3结果分析-37-

5.3.1植物疫苗胁迫下不同作物根系土壤微生物PLFAs测定-37-

5.3.2植物疫苗胁迫下不同作物根系土壤微生物PLFAs组成及含量比较-39-

5.3.3植物疫苗胁迫下不同作物根系土壤微生物群落结构变化动态-43-

5.3.4植物疫苗胁迫下不同作物根系土壤微生物群落结构多样性分析-44-

5.4讨论-46-

第六章不同植物根系提取液对植物疫苗工程菌FJAT-1458的影响-48-

6.1引言-48-

6.2试验材料-48-

6.2.1样本采集-48-

6.2.2样品的处理-49-

6.2.3培养基及仪器-49-

6.3试验方法-49-

6.3.1植物疫苗工程菌及菌液的制备-49-

6.3.2不同作物根系提取液对植物疫苗工程菌FJAT-1458生长特性的影响-49-

6.3.3数据统计分析-50-

6.4结果与分析-50-

6.4.1植物疫苗工程菌FJAT-1458培养液的浓度测定-50-

6.4.2不同作物根系提取液对植物疫苗工程菌FJAT-1458生长特性的影响-50-

6.5讨论-53-

第七章结论和展望-55-

7.1结论-55-

7.2展望-55-

衣剂在一段时间内可以有效控制青枯病病害.农用链霉素是目前生产上防治烟草青枯病最常用的一种药剂,其有效成分就是灰链霉菌的发酵产物.

1.1.3.4其它生防因子的应用

除芽孢杆菌,检测单杆菌和放线菌三大类微生物外,国内外学者也曾尝试将其它微生物和植物提取物用于植物青枯病的防治.黎起秦等[]筛选到一株哈茨木霉对番茄青枯病的防治在室内取得了较好的效果.印度ures等[]学者发现受泡囊丛枝状菌(Vesieles-ArbuseulesMyeorrhizae,VAM)感染的番茄根围菌根提取物可抑制青枯雷尔氏菌的生长.朱红惠等[]发现AM真菌可以抑制青枯病菌,影响土壤中青枯菌和其它细菌数量,对番茄苗有较好的延缓青枯病发生的能力.某些植物提取物也对青枯病菌有抑制作用,如山苍子,大蒜,黄茂提取物对烟草青枯病菌有明显的抑制作用[6566].

虽然对青枯病生防菌的筛选以及防效研究是国内外学者研究的热点,也有不少关于青枯病生防菌的报道,在实验室内或小区试验中均有很好的抑制作用,受多种因素的制约,目前为止生防产品由实验室向大田推广应用的并不多,且生防制剂多为活菌制剂.目前生防菌田间的作用体系,作用方式尚未明了,而且田间应用时容易受到土壤微生物,土壤性质,外界温湿度等[-43]多种因素影响,从而无法控制其田间防治效果导致各区域防效差异显着.因此,加强生防菌作用机制的研究,探索生防菌在施用环境中与病原菌,植物的互作机制是有效发挥生防菌作用效果的重要途径.

1.2番茄青枯病生物防治机制的研究

1.2.1生防菌定殖的研究进展判断筛选的生防菌株生防能力如何,最重要的是其能否在寄主植物根围及植株体内定殖.目前有大量青枯病病原菌及无致病力菌株在植株定殖分布的文章,如王铮敏等[]研究了不同发病期茄子植株体内青枯菌的分布刘波,朱育菁等[]研究了青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性,表明青枯雷尔氏菌能在植株体内定殖.杨宇红等[]构建工程菌无致病力青枯雷尔氏菌hrP突变体主要通过位点和营养竞争影响青枯致病菌在寄主上的附着或营养的摄取,从而起到控病的作用.杨威等[]对细菌定殖能力与其生物防治功能相关性研究进展做了详细介绍,吕建林等[]研究了烟草青枯病生防菌混合接种对其定殖及防效的影响.任欣正等[41]发现无致病力青枯雷尔氏菌菌株noE-104能在番茄植株根部定殖,并对致病菌在根部的增殖有抑制作用,说明该菌对青枯病的防治作用和无致病菌占据了一定的定殖位点有关.朱育菁等[]研究了青枯强致病力与无致病力菌株生长竞争关系,无致病菌株在一定时间内具有高于强致病力菌的生长能力,当与强致病力菌混合时,能较快成为优势种群.扫描电镜激光共聚焦显微镜荧光显微镜[50]利用绿色荧光蛋白Olivain[51]利用激光共聚焦显微镜AnastasiaL等[52]利用扫描电镜等技术研究了生防菌在植株中的定殖状况.传统的稀释涂板法,因操作简单,方便目前也被广泛应用于检测具有特殊标记的生防菌的定殖特性.

1.2.2生防菌对植株防御酶系统的研究进展

氧化物酶POD),超氧化物歧化酶SOD),多酚氧化酶PPO)是形成多种抗菌作用物质的关键酶,也是植株防御系统的重要组成物质.许多研究结果表明,无论是真菌,细菌,病毒或是它们的代谢产物,糖蛋白,毒素等都可作为诱导因子,诱导植物产生抗性,与植物抗病性有关的酶如PODSOD,PPO的活性均有显着增加.SOD,POD,PPO,苯丙氨酸氨裂解酶PAL),脂肪酸氧化酶LOX)等均通过不同的方式直接或间接参与植株防御酶系统[3-57].Keppler等[8]研究发现,O2一POD不仅参与了木质素的沉积过程,而且在清除H2O2和O2一自由基方面具有重要防御作用.SOD在,它可以清除O2一以避免对细胞的伤害.PPO是细胞抗性酶之一,其作用机制是将细胞代谢产物中的酚类物质氧化为醌类来杀死细胞限制病原物进一步扩展.

植物对外界环境变化敏感,在紫外线辐射,微量元素施肥,重金属及微生物所产生的压力下,容易产生对细胞有毒害作用的活性氧成分activatedoxygenspecies,AOS[59-63].植物通过自身代谢机制分解这些活性氧成分.抗氧化酶系统在分解AOS中具有重要作用,包括可以催化O2一形成H2O2的SOD和去除H2O2毒性的POD以及PPO等,这些酶以多种形式存在于植物组织中,从而使植物免受AOS氧化作用而产生损害前人的大量研究表明,干旱,水涝,植物病原微生物以及内生菌[4-66]等可提高植株不同部位抗氧化酶如SOD,POD,PPO等酶的活性.植物疫苗和番茄植株的,为植物疫苗的开发应用提供理论依据.1.2.3生防菌定殖土壤微生态的研究

根际微生态是由植物-土壤-微生物组成的一个动态变化的生态系统[7].受到多种因素的影响.生防菌能否很好的定殖于植物根际土壤,根系微生物种群结构作物产量根际微生物能否达到平衡状态,是生菌防治土传病害重要因子.

所有生物活细胞膜磷脂不同微生物具有不同的PLFA的种类和数量,一些脂肪酸只特异性地存在于某种微生物细胞膜中[8].微生物磷脂脂肪酸组成与含量具有种属的特异性,由于存在于活体微生物细胞膜的磷脂脂肪酸分布广泛且含量相对稳定,对环境的变化敏感,分析方法简单,因此,PLFAs技术被广泛应用于土壤微生物学研究.目前,脂肪酸生物标记[69].IbekweAM等[70]用脂肪酸生物标记法MerrySR等[71]利用PLFAs技术PLFAs技术与传统稀释涂板法,氯仿熏蒸法和BIOLOG分析相比,手段.

1.2.4根系提取液对生防菌的研究

根系作为一种连接土壤和植物的重要媒介,对植物的生长起到了非常重要的作用.目前利用根系提取液及根分泌物防治病原菌的防治有广泛的报道,范志宏等[]研究了万寿菊根提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性成分及作用机理,李勇等[]研究了根系分泌物及其对植物根际土壤微生态环境的影响.利用有关植物提取物同病原菌作用的研究的报道局限在对植物根,茎,叶及根分泌物的成分分析上,尚未见对不同植物根系提取液作用的报告[-76].根系提取液是在研究根提取液的基础上,对植物的根分泌物及土壤中的物质成分的研究,这对研究植物同病原菌的关系有更为广泛的意义.

1.3番茄青枯病植物疫苗研究及其应用前景

利用无致病力细菌素产生菌防治细菌性青枯病是七十年代末开始尝试的防法,近年来广泛受到植物病理学研究者的重视.而植物疫苗是最近几年才提出的,前研究认为植物没有循环系统,就没有疫苗.但是经过研究发现植物体内也有水分和养料循环系统植物在感受外界后调整内部的能力给植物产生抗,排除其他细菌入侵,达到防治病菌的效果植物疫苗.植物体内细菌生物竞争方式养分生态位占领.病原菌分化,在菌的分化中找到无致病菌,先植物体内,其他菌进的可能性.但无致病菌是多样性的,植物疫苗和动物疫苗,动物疫苗进入动物体内后会自动复制但是植物疫苗无致病的原理研究一种长期存在植物体内的无致病菌株LumK.Y.[],TsaiJ.W.[],A.Trigalet[]等均先后报道了利用无致病力细菌素产生菌对植物青枯病防治的研究.台湾Chen[]用无致病力青枯雷尔氏菌121菌株,Hara[81]用无致病力青枯雷尔氏菌OM2菌株任欣正等[]用无致病力青枯雷尔氏菌菌株MA-7和nOE-104防治番茄青枯病,均取得温室或小区试验的良好防效,但后期防效降低,大田试验均未能取得较好效果,这可能主要由于无致病力青枯雷尔氏菌菌株在大田土壤中不能大量繁殖,缺乏与其它微生物的竞争力所致.王羽等[]从有青枯病的番茄茎中分离出的无致病力青枯菌,温室盆栽试验筛选得到2株有较好控病效果,防效分别为43%和47%.陈庆河等[]用紫外诱变法获得的两株青枯无致病力菌株盆栽试验结果表明,番茄经无致病力菌株AimO44和ASp061处理后,均可推迟发病,20d后的防效分别为56.7%和53.4%.田间小区试验15d后对青枯病的防效分别为53.8%和37.7%.肖田[]分离到的无致病力青枯雷尔氏菌菌株Tmjdl-3和Aujds-2-1对烟草青枯病温室控病效果较好,20d后的相对防效分别为58.4%和97%.因此,研制出一种对植物不会产生大的过敏反应,能够长期存在植株体内且具有较高防效的无致病菌株作为植物疫苗具有重大意义.该疫苗如果研制成功,可显着缩减农作物药物成本,具有广泛的应用前景.

本研究的目的及意义

生物防治对作物生产的可持续发展具有较好的应用前景,而无致病力青枯雷尔氏菌是作物青枯病生防材料的重要来源.利用无致病力青枯菌防治青枯病的优点是,其能在与青枯菌相似的生态条件下发挥生防作用,且对生态环境影响不大.从上世纪年始植物病理学家就开始了无致病力青枯菌对青枯病控病可能性和机理的研究,到目前为止,虽没有无致病力青枯菌的产品问世,但在青枯病控病试验中短期防效表现良好,具有一定的生防潜力.对于青枯无致病力菌株对青枯菌的拮抗机理,目前主要存在有两种观点一是认为交叉保护和诱导寄主产生抗病性,使寄主植物产生过敏性反应二是认为无致病力菌株产生了细菌素.但对于细菌素对青枯菌的作用机制也存在两种观点,有的认为细菌素具有抗生作用,可以抑制青枯菌的生长和繁殖,从而降低病原菌的数量,减少了病原菌的侵入机会,有的学者认为细菌素的作用是诱导寄主对青枯病产生抗病性.

植物疫苗FJAT-1458是福建省农业科学院刘波研究小组从病区番茄植株分离获得一株青枯病防效较好的疫苗菌株.课题组对该生防菌的形态特征,生化特性,大田试验等进行了大量研究,并研制出植物疫苗鄂鲁冷特为了进一步了解植物疫苗FJAT-1458的生防机理本试验研究了番茄青枯病植物疫苗植物疫苗FJAT-1458的免疫抗病机理有重要意义.

第二章番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选

2.1引言

番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种毁灭性土传病害[3],在我国四川,浙江,福建,江西,广东,广西等省区发病较重,造成农业生产巨大的经济损失,其防治工作一直备受关注[,87].由于青枯雷尔氏菌在土壤中的存活时间长,传播快,尚无理想的防治措施.化学防治污染环境,危害人类健康,且未发现有效的化学药剂采用轮作可起到一定的防治作用,但实施比较困难[],抗病育种概率小,难度大,尚未见有成功的报道[].利用青枯雷尔氏菌的弱株系作为植物疫苗来防治番茄青枯病是一种新的尝试.

作植物疫苗.不同接菌浓度和不同接菌天数对番茄青枯病生防效果的影响最佳施用浓度和最佳施用时间,为青枯病植物疫苗的.

2.2试验材料无致病力和强致病力均由福建省农科院农业生物资源所微生物研究中心菌种资源库.供试菌株表1不同寄主青枯雷尔氏菌菌株及来源

Tab2-1SourcesofRalstoniasolanacearumfromdifferenthostplants

菌株编号菌株致病性FJAT-1458番茄南平建瓯FJAT-1444姜南平建瓯FJAT-1465番茄南平建瓯FJAT-1452番茄南平建瓯FJAT-1442姜南平建瓯FJAT-1441姜南平建瓯FJAT-91番茄福州闽侯FJAT-T21番茄FJAT-91致弱AFJAT-T6番茄FJAT-91致弱AFJAT-T5番茄FJAT-91致弱AFJAT-T4番茄FJAT-91致弱AFJAT-T2番茄FJAT-91致弱AFJAT-T33番茄FJAT-91致弱AFJAT-T7番茄FJAT-91致弱AFJAT-T1番茄FJAT-91致弱AFJAT-T8番茄FJAT-91致弱AFJAT-T11番茄FJAT-91致弱AFJAT-T12番茄FJAT-91致弱A"V":irulentRalstoniasolanacearumstrain,"A":AvirulentRalstoniasolanacearumStrain供试品种:选用的番茄品种为金石王1号,番茄种苗购自厦门如意集团农业科技有限公司.

2.试验方法

2..1番茄青枯病植物疫苗工程菌的筛选

(1)番茄植株培养:将番茄种苗移栽至盆钵种植,盆钵直径15cm,高10cm,每盆装无菌土3kg,每盆移栽1株番茄苗(选择长势一致的苗),30℃)培养,备用.

(2)菌液的制备将供试菌株TTC培养基上活化,挑取单菌落于SPA培养液中,置于30℃,200r/min摇床上培养24h,×106cfu/mL,采用伤根接种法[],用灭菌手术刀在番茄苗根部周围的根系划2刀伤根后灌根接种无致病力青枯雷尔菌,50mL/盆,处理盆无致病力青枯雷尔菌3天后FJAT-91,3d后观察植株发病情况无致病力青枯雷尔氏菌植株发病无致病力青枯雷尔氏菌2.3.2番茄青枯病植物疫苗番茄青枯病防效的FJAT-1458作为植物疫苗TTC培养基上活化,挑取单菌落于SPA培养液中,置于30℃,200r/min摇床上培养24h,不同接种浓度处理稀释(1×108,1×107,1×106,1×105,1×104cfu/mL)接种于6-7叶龄的番茄根部,50mL/盆,每种浓度,对照.3d后灌根接种FJAT-91,接种浓度为1×106cfu/mL

(3)防效比较:统计不同接种浓度的工程菌FJAT-1458处理后番茄植株发病.番茄青枯病植物疫苗番茄青枯病防效的将植物疫苗TTC培养基上活化,挑取单菌落于SPA培养液中,置于30℃,200r/min摇床上培养24h,确定原始浓度的无致病力青枯雷尔氏菌株,用无菌水进行10倍系列稀释,制备试验所需浓度的菌液,备用.不同接种浓度处理:灌根法接种番茄青枯病工程菌FJAT-1458灭菌手术刀在番茄组培苗根部周围的根系划2刀,然后用浓度为1×106cfu/mL的FJAT-1458间隔时间(0d,3d,6d)灌根接种于6~7叶龄伤根的番茄根部,CK1,CK2组在伤根后用清水代替菌液.2)第6d灌根接种浓度为1×106cfu/mL的强致病力FJAT-91菌液CK2组用清水代替菌液.观察番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458不同番茄青枯病生物防治能力.

2..4番茄青枯病植株病原菌的的植株预处理:植株先用清水清洗,用滤纸将植株水分吸干.称样及样品处理:称取根,茎基部,茎中部,茎顶部,叶各1g,先用75℅酒精消毒30s再用10℅的NACLO消毒5min,然后用无菌水清洗3遍,再用灭菌滤纸将样品吸干,放至装有10mL无菌水的研钵,充分研磨,即配成10-1浓度,稀释样品原液:吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管,即配成10-2浓度,依次稀释配置成10-3.平板涂布:,在振荡器上振荡1-30s,菌液混合均匀吸取200μL,用涂布棒涂匀静置恒温箱培养:将涂好的平板用袋子装好倒置于30℃恒温箱中培养h.菌落纯化:,标记要纯化的菌落标30℃恒温培养箱倒置培养48h.

采用水煮法提取上述分离的病原菌DNA.特异性引物pehA#3和pehA#6进行鉴定,引物序列为,pehA#35'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3'和pehA#65'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3'.扩增得到的片断大小为504bp.25μl的反应体系为:DNA模板10-20ng,Taq(5U/μl)0.3μl,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTP(10mM)0.5μl,引物pehA#3和pehA#6(10μM)各1μl加无菌水至25μl.反应程序:首先96℃1min,然后按96℃30s,70℃30s,72℃1min程序2个循环,再按94℃30s,70℃30s,72℃1min程序33个循环,最后72℃下延伸5min.

2.3试验结果

2.3.1番茄青枯病植物疫苗菌株的筛选

分别以强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91和清水为阳性对照和阴性对照,对青枯雷尔氏菌自然突变株FJAT-1441,FJAT-1442,FJAT-1452,FJAT-1465,FJAT-1458和Tn-5插入致弱菌株FJAT-T1,FJAT-T7,FJAT-T33,FJAT-T2,FJAT-T4,FJAT-T5,FJAT-T6,FJAT-T21,FJAT-T12,FJAT-T8,FJAT-T11进行致病性和防效鉴定.由表2-可知,不同的无致病力青枯雷尔氏菌的防效差异很大,阳性对照在接种后第4d开始发病,第8d发病率达到100%.先接种无致病力青枯雷尔氏菌,3d后再接强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91,各无致病力菌株均表现出一定的生防效果.其中自然突变株FJAT-1458防效最好,在整个调查期内发病率为0Tn-5插入致弱菌株中T8防效最好接种致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91后第13d发病率仅为5%防效达95%.以不同致病力的青枯雷尔氏菌为样本,以接种强致病力青枯雷尔氏菌后不同时间番茄植株的发病率为指标进行聚类分析,结果如图2-1所示,当欧氏距离为0.6888时,可将各菌株分为三大类,第一类为工程菌FJAT-1458,该类特点为发病率为0,防效达到100%第二类包括菌株FJAT-T8,FJAT-T11,FJAT-1444,FJAT-1465,该类特点为发病率均小于40%防效达到60以上第三类包括FJAT-T1,FJAT-T7,FJAT-T33,FJAT-T2,FJAT-T4,FJAT-T5,FJAT-T6,FJAT-T21,FJAT-1441,FJAT-1442,FJAT-1452,FJAT-T12,该类特点为发病率均大于45%.综上各无致病力青枯雷尔氏菌的防效评价,选出青枯雷尔氏菌自然突变株FJAT-1458作为植物疫苗.

表2-番茄青枯病植物疫苗的筛选Tab.2-2Thescreeningofplantvaccineengineeringbacteriaabouttomatobacterialwilt

菌株发病率(%)4d5d6d7d8d9d10d11d12d13dFJAT-T10.000.000.000.0010.0010.0020.0020.0030.0045.00FJAT-T20.000.0015.0040.0040.0065.0070.0070.0080.00100.00FJAT-T40.000.0025.0045.0050.0065.0075.0075.0080.00100.00FJAT-T50.000.0020.0045.0055.0070.0070.0075.0080.00100.00FJAT-T60.000.0020.0045.0050.0060.0065.0075.0080.00100.00FJAT-T70.000.0010.0020.0040.0040.0045.0055.0060.0060.00FJAT-T80.000.000.000.000.000.000.000.000.005.00FJAT-T110.000.000.000.000.000.000.000.000.0010.00FJAT-T120.000.0010.0010.0030.0050.0050.0070.0080.0090.00FJAT-T210.000.0020.0030.0050.0080.0095.0095.00100.00100.00FJAT-T330.000.000.0015.0025.0030.0050.0050.0060.0060.00FJAT-14410.000.0020.0045.0050.0060.0065.0075.0075.00100.00FJAT-14420.000.0020.0045.0050.0060.0065.0075.0085.00100.00FJAT-14440.000.000.000.000.0010.0010.0020.0020.0020.00FJAT-14520.000.000.0010.0030.0030.0060.0080.0090.00100.00FJAT-.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00FJAT-14650.000.000.000.000.0010.0015.0020.0020.0030.00G+0.0010.0060.0090.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00G-0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00

图2-1菌株防效聚类图Fig.2-1ClusteringfigureofbiologicalcontrolefficacyfromdifferentRalstoniasolanacearum

2.3.2番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458的接种浓度对番茄青枯病防效的影响

设定番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458不同接种浓度104cfu/mL,105cfu/mL,106cfu/mL,107cfu/mL,108cfu/mL和清水对照(CK),采用伤根接种法,先接种不同浓度的植物疫苗工程菌FJAT-1458,3d后再接种强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91,接种强致病力青枯雷尔氏菌后每天观察番茄植株的发病情况,统计不同处理番茄植株的发病率,试验结果见表2-和图2-2.当无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458的接种浓度为108cfu/mL,番茄植株出现烧苗症状,清水对照接种强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91后第4d开始发病,番茄植株出现萎蔫症状,并随着时间的推移日益严重,至第10d发病率达100%.分别先接种104cfu/mL,105cfu/mL,106cfu/mL,107cfu/mL,108cfu/mL的植物疫苗工程菌FJAT-1458,再接种接种强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91,至第10d发病率分别为80%,80%,35%,15%和0,防效分别达20%,20%,65%,85%和100%.随着时间推移,植物疫苗工程菌FJAT-1458接种浓度为104cfu/mL和105cfu/mL处理组的发病率在第11d,13d分别达到100%,比对照分别推迟1d和3d植物疫苗工程菌FJAT-1458接种浓度分别为106cfu/mL,107cfu/mL,108cfu/mL的处理组,它们在第20d的防效分别达15%,40%,90%.因此不同浓度植物疫苗工程菌FJAT-1458处理后番茄均能有效减缓青枯病病程发展,当植物疫苗菌株浓度大于1×106cfu/mL时,对番茄青枯病的生防效果明显,并且随着浓度增大,效果越好.接种不同浓度植物疫苗工程菌FJAT-1458对番茄苗效果较好的菌株为108cfu/mL.当生防菌浓度小于1×106cfu/mL时,对番茄青枯病的防效不明显,且防效差异不大.清水处理的CK2均无植株发病.

表2-接种不同倍数的FJAT-1458后番茄青枯病发病率(%)Tab.2-3ThemorbidityoftomatobacterialwiltafterdifferentconcentrationsofFJAT-1458

回接天数(d)稀释不同倍数的植物疫苗cfu/mL)104105106107108ck1ck250.000.000.000.000.0025.000.00625.0025.000.000.000.0040.000.00735.0035.0010.000.000.0085.000.00865.0065.0010.000.000.0085.000.00970.0080.0010.000.000.0095.000.001080.0080.0035.0015.000.00100.000.0011100.0085.0050.0020.000.00100.000.0012100.0095.0055.0030.000.00100.000.0013100.00100.0055.0030.000.00100.000.0014100.00100.0065.0035.000.00100.000.0015100.00100.0075.0045.005.00100.000.0020100.00100.0085.0060.0010.00100.000.0025100.00100.00100.0085.0040.00100.000.00

根据不同浓度无致病力菌株接种处理后番茄青枯病的发病率,绘制发病率的趋势图(图2-2),可看出随着处理的浓度增加,植株的发病率明显降低并推迟植株的发病.

图2-2接种不同浓度FJAT-1458后番茄青枯病的发病率趋势图

Fig.2-2ThemorbiditytendencychartoftomatobacterialwiltdifferentconcentrationsFJAT-1458

2.2.3番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458的接种时间对番茄青枯病防效的影响

试验结果见表2-3,回接4d后,的番茄苗开始出现萎蔫现象,表现出青枯病的症状,第6d发病率为25%,并且随着时间的推移而日益严重,在回接后11d,所有植株都发病,发病率达100%.而经伤根处理接种植物疫苗菌株的番茄苗较对照均推迟发病,接种植物疫苗工程菌FJAT-1458的处理较对照分别推迟3,2,2d发病.接种10d后,防效分别为60%,45%,45%2生长正常.比较接种植物疫苗工程菌FJAT-1458的三组处理,0d组平均防效最好,3d6d组防效差异不大.

表2-3不同天数接种FJAT-1458后番茄青枯病的发病率Tab.2-3ThemorbidityoftomatobacterialwiltwithdifferentdaysofFJAT-1458

回接天数(d)不同处理0d3d6dck1ck250.000.000.005.000.0060.005.0010.0025.000.0075.0010.0030.0075.000.00815.0025.0040.0085.000.00915.0045.0045.0095.000.001020.0055.0055.0095.000.001130.0060.0055.00100.000.001245.0060.0055.00100.000.001355.0060.0060.00100.000.001455.0070.0065.00100.000.001560.0075.0070.00100.000.001665.0075.0070.00100.000.001765.0075.0075.00100.000.001875.0080.0080.00100.000.001985.0085.0080.00100.000.002085.0085.0080.00100.000.002585.0090.00100.00100.000.00

2.3.4试验获得番茄青枯病植株病原菌的的利用特异性引物对pehA#3和pehA#6进行的鉴定,鉴定结果如图2-3所示,扩增片断大小约为500bp.图2-3利用特异性引物对10株菌株鉴定的结果Fig.2-3MolecularidentificationoftenRalstoniasolanacearumstrainswithspecificityprimers

M:3000bpMarker,+:RalstoniasolanacearumGMI1000,-:CK,Serialnumber:Unidentifiedstrains2.4讨论通过对青枯雷尔氏菌自然突变株和Tn-5插入致弱菌株进行致病性和防效鉴定自然突变株FJAT-1458防效最好,在整个调查期内发病率为0因此选择FJAT-1458作为植物疫苗进一步研究.工程菌FJAT-1458当工程菌FJAT-1458浓度小于1×106cfu/mL时,番茄青枯病的,1×108cfu/mL时,番茄青枯病的.,同时接种工程菌FJAT-1458和菌株FJAT-91,,工程菌FJAT-14583d,6d再接种菌株FJAT-91,番茄青枯病的发病率较高,致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91处理25d后发病率分别为85%,90%,100%.

接种高浓度的植物疫苗FJAT-1458的番茄植株发病率较低,可能是由于青枯雷尔氏菌的强致病力与无致病力菌株生长存在竞争关系人工大量施用植物疫苗时,能有效地保护番茄植株在生长初期免受青枯病的危害在短期内起到一定的防治效果的原因所在,且两种菌株施用时间越相近,植物疫苗菌株能较快成为优势种群.但随着时间的延长,番茄青枯雷尔氏菌的强致力菌株有着比无致病力菌株更强的生长能力[],强致病力菌株又重新成为优势种群.这可能是导致防效迅速下降的原因之一

第三章植物疫苗FJAT-1458在番茄植株的定殖特性

3.1引言

目前有大量青枯病病原菌及无致病力菌株在植株定殖分布的文章,刘波等[]研究了青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性,表明青枯雷尔氏菌能在植株体内定殖杨宇红等[]利用无致病力hrp2突变体防治茄科蔬菜青枯病,并采改良蘸根接种法用无致病力hrp2突变体预处理,能有效提高青枯病防治效果判断筛选的生防菌株生防能力如何,最重要的就是其能否在寄主植物根围及植株体内定殖.利用番茄幼苗研究了植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄幼苗不同时期不同部位的定殖情况这对我们进一步利用防治青枯病具有重要的意义.3.2试验材料

3.2.1供试供试病原菌FJAT-91及植物疫苗工程菌FJAT-1458均由福建省农科院农业生物资源所微生物研究中心提供.

3.2.培养基

TTC/L:蛋白胨10.0g,水解酪蛋白1.0g,葡萄糖5.0g,TTC(23,5-氯化三四氮唑)0.05g,pH7.0-7.2(注:TTC用蒸馏水配成1%溶液并用细菌过滤器过滤灭菌,在培养基倒平板前(冷却至约50℃)每100.mL培养基加入0.5mL.)

SPA培养基:5g蛋白胨,20g蔗糖,0.5gKH2PO4,0.25gMgSO4,1000mL蒸馏水,分装,121℃灭菌20min,最终pH值为7.2-7.4.

3.2.供试番茄

金石王1号番茄实生苗培育2-3叶期幼苗5-6叶期成苗番茄种苗购自厦门如意集团农业科技有限公司.

3.试验方法

3..1菌液的制备

将划线于TTC琼脂平板上,在30℃条件下培养48h,挑取单菌落于装有50mLSPA培养液的250mL三角瓶中,于30℃,200r/min摇床培养48h.将菌液混匀,,确定菌液的原始浓度,数量级为109,根据试验需要稀释,备用.

3..2植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖数量

将菌液混匀,用平板涂布计数,确定菌液的原始浓度,数量级为109,依次稀释到104cfu/mL106cfu/mL(处理2),108cfu/mL(处理3)浓度.用稀释后的菌液灌根处理番茄2-3叶期盆栽苗,50mL/盆,每处理30盆,对照用水代替菌液.在接种后3,6,9,12,15,18,21d取样,每个处理随机取3株番茄植株,测定FJAT-1458在土壤及植株各部位的定殖情况.

3..3植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖数量比较

用稀释后的106cfu/mL植物疫苗工程菌FJAT-1458菌液浓度灌根处理番茄2-3和5-6叶期盆栽苗,50mL/盆,每处理30盆,对照用水代替菌液.在接种后3,6,9,12,15,18,21d取样,每个处理随机取3株番茄植株,测定FJAT-1458在土壤及植株各部位的定殖情况.

3..4土壤青枯雷尔氏菌的分离

土壤称样:称取5g土壤至装有45mL无菌水的三角瓶,摇床振荡15min,使之充分溶解,即配成10-1浓度,稀释土壤原液:吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管,即配成10-2浓度,依次稀释配置成10-3,10-4,10-5.平板涂布:,在振荡器上振荡1-30s,菌液混合均匀吸取200μL,用涂布棒涂匀静置恒温箱培养将涂好的平板用袋子装好倒置于30恒温箱中培养h.菌落纯化:,标记要纯化的菌落标30℃恒温培养箱倒置培养48h.结果计算:每克土样中微生物的数量等于同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品3.3.5植株体内青枯雷尔氏菌的分离

植株预处理:植株先用清水清洗,用报纸将植株水分吸干.称样及样品处理:称取根,茎基部,茎中部,茎顶部,叶各1g,先用75℅酒精消毒30s再用10℅的NACLO消毒5min,然后用无菌水清洗3遍,再用灭菌滤纸将样品吸干,放至装有10mL无菌水的研钵,充分研磨,即配成10-1浓度,稀释样品原液:吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管,即配成10-2浓度,依次稀释配置成10-3.平板涂布:,在振荡器上振荡1-30s,菌液混合均匀吸取200μL,用涂布棒涂匀静置恒温箱培养:将涂好的平板用袋子装好倒置于30恒温箱中培养h.菌落纯化:,标记要纯化的菌落标30℃恒温培养箱倒置培养48h.结果计算:每克土样中微生物的数量等于同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品.

3..6植株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定

挑取2环纯化好的植株体内分离的青枯雷尔氏菌于1.5mL离心管中,加入200μL无菌水,水浴10min,8000r离心1min,吸取上清液于-20℃保存.把纯化保存的似青枯雷尔氏菌落形态的单菌落的DNA用特异性引物pehA#3和pehA#6进行鉴定,引物序列为,pehA#3:5'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3'和pehA#6:5'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3'.扩增得到的片断大小为504bp.25μL的反应体系为:DNA模板10-20ng,Taq(5U/μL)0.3μL,10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP(10mM)0.5μL,引物pehA#3和pehA#6(10μM)各1μL加无菌水至25μL.PCR反应程序:96℃预变性1min,96℃变性30s,70℃退火30s,72℃延伸1min,2个循环,94℃变性30s,70℃退火30s,72℃延伸1min,33个循环,最后72℃下延伸5min.

3.结果与分析

3..1植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖数量

由图3-1,图3-2,图3-3可知,不同浓度FJAT-1458菌液在第6天在土壤的定植量达到最大,灌根浓度108cfu/mL在土壤中的定殖浓度最大.

图3-1不同浓度,不同天数FJAT-1458在土壤的定植情况Fig.3-1ThecolonizationsituationofFJAT-1458withdifferentconcentrationsanddaysinsoil

第12天104cfu/mL灌根浓度的土壤中已无分离到目标菌,第15天各浓度处理的土壤均无分离到目标菌.不同浓度FJAT-1458菌液在第6天在根的定植量达到最大,第18天各处理均无分离到目标菌.处理1在茎中无分离到目标菌,第12天处理2,3定殖量达到最大,第21天各处理均无分离到目标菌.在叶上各处理中均无分离到目标菌.处理2和处理3目标菌的定殖情况相差不大,因此可以选用处理2作为我们下一步试验的处理浓度.

图3-2不同浓度,不同天数FJAT-1458在根部的定植情况Fig.3-2ThecolonizationsituationofFJAT-1458withdifferentconcentrationsanddaysinroot

图3-3不同浓度,不同天数FJAT-1458在茎的定植情况Fig.3-1ThecolonizationsituationofFJAT-1458withdifferentconcentrationsanddaysinstems

3.4.2植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖数量比较

由图3-4,图3-5,图3-6可知,FJAT-1458在番茄幼苗不同生长期的土壤定殖量差异不大.在根部第6d定殖量达到最大,在茎部第12d定殖量达到最大,且2-3叶期的番茄苗的在茎部的定殖量明显高于5-6叶期的番茄苗.而在清水对照中的土壤及植株均无分离到青枯雷尔氏菌.

图3-4不同生长期FJAT-1458在土壤的定植情况Fig.3-4ThecolonizationsituationforFJAT-1458ofdifferentgrowthperiodsinsoil

图3-5不同生长期FJAT-1458在根部的定植情况Fig.3-5ThecolonizationsituationforFJAT-1458ofdifferentgrowthperiodsinroot

图3-6不同生长期FJAT-1458在茎的定植情况Fig.3-6ThecolonizationsituationforFJAT-1458ofdifferentgrowthperiodsinstems

图3-7灌根处理12d后番茄盆栽苗的生长情况Fig.3-7Thetomatopotgrowingafterinoculatingtwelvedayswithirrigationroot

3.4.3植株体内分离的青枯雷尔氏菌的分子鉴定

由图3-8,3-9可知,分离到的目标菌在504bp处检测到了特异性条带,表明青枯雷尔氏菌已经成功在植株定殖.

图3-8FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖量的检测Fig.3-8MolecularidentificationofFJAT-1458colonizationcontentindifferentpartsoftomatoplant

M:3000bpMarker,+Ralstoniasolanacearum,-:CK,Serialnumber:Unidentifiedstrains

图3-9FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖量的检测Fig.3-8MolecularidentificationofFJAT-1458colonizationcontentindifferentgrowthperiodsoftomato

M:3000bpMarker,+:RalstoniasolanacearumGMI1000,-:CK,Serialnumber:Unidentifiedstrains

3.5讨论

当外源生防菌株施用到植物根围后,不同微生物在根系土壤中的定殖,侵染方式也不一样.祝明亮等[]的研究表明,淡紫拟青霉的定殖在不同时期,不同品种中均有区别.生防菌同土壤中微生物竞争能力的强弱是其在土壤中存活的关键.Bull等[]研究了荧光检测单胞生防菌株2-79在小麦根部不同部位定殖量与小麦全蚀病病斑数之间的关系证明生防菌株2-79的定殖量与寄主植物病斑数成反比定殖量越大病斑产生的数量越小.当根部定殖量达到107-108cfu/时几乎不产生任何病斑.黎起秦等[]报道枯草芽孢杆菌B47在番茄植株根和茎中定殖量达到104cfu/g的时候其对番茄青枯病的防治效果能够达到79.79%.这表明对生防菌定殖的研究是研究植物病害生防效果的前提.

通过对定殖浓度筛选表明,定殖浓度必需达到一定的大小,才能在植株体内有效的定殖,而106cfu/mL和108cfu/mL在植株的定殖量差别不大.比较的定殖差异,表明植株幼苗越小越有利于的定殖.这可能由于植株幼苗的根系生长较快,且根系较嫩,青枯雷尔氏菌更容易侵入到植株体内.植株青枯病苗期就开始发病,初果后发病严重可能同青枯雷尔氏菌的侵入特征有联系.因此在防治植株青枯病的时,应选择在幼苗期对其进行防治,这样能起到更好的效果.结果表明,cfu/mL,其在番茄植株体内的定殖时间只有12d,且只在植株根部定殖,在茎和叶均无定殖.当植物疫苗工程菌FJAT-1458接种浓度为106cfu/mL和108cfu/mL,其在番茄植株体内的定殖时间可达18d.当接种浓度为106cfu/mL时,接种的番茄植株苗龄越小,工程菌FJAT-1458在番茄植株及根系土壤的定殖量越大,这为无致病力菌株的开发利用提供了理论依据.细菌的定殖一般情况下同可细菌的鞭毛和菌毛密切相关如检测单胞属细菌必需靠鞭毛才能在各种表面定殖,细菌的游动性也主要是通过鞭毛来实现的[].细菌的定殖还同细菌的趋化性有关,这种趋化性信号途径是有一系列基因编码的[].植物的根系分泌物对某些细菌也具有趋化性,我们可以通过这些现象检测定根系分泌物种的特定成分在根围菌落的定殖中具有重要作用[].他们可以作为诱导剂增强菌株的定殖能力.菌株的次生代谢产物也可与帮助它们增强在寄主中的竞争能力从而在定殖中占据优势[].这些因素均同菌株的定殖能力密切相关,因此在研究菌株的定殖能力的同时,考虑各种条件的影响对我们更充分利用生防菌防治病害有重要意义.

第四章植物疫苗对番茄青枯病免疫抗病的生理机制

4.1引言

目前对番茄青枯病的研究主要集中在生防菌的筛选及其防治效果研究,对其诱导植株产生抗性方面的研究相对较少,对诱导处理后引起番茄植株生长特性及防御酶系统影响报道尚不多见.陈庆河等[8]用紫外诱变法获得无致病力青枯雷尔氏菌,发现用其处理番茄后,能诱导番茄植株过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)活性增加.本研究利用一株从番茄植株自然分离到的无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458作为植物疫苗,接种番茄植株,分析接种后番茄植株生长特性及超氧化物歧化酶(superoxidediutase,SOD),POD和PPO活性变化,初步了解植物疫苗和番茄植株的互作关系,为植物疫苗的开发应用提供理论依据.

1材料和方法

4.2试验材料.2.1供试植物疫苗工程菌FJAT-1458由福建省农科院农业生物资源所微生物研究中心提供.

.2.2培养基

1)TTC/L:蛋白胨10.0g,水解酪蛋白1.0g,葡萄糖5.0g,TTC(23,5-氯化三四氮唑)0.05g,pH7.0-7.2(注:TTC用蒸馏水配成1%溶液并用细菌过滤器过滤灭菌,在培养基倒平板前(冷却至约50℃)每100.mL培养基加入0.5mL.)

2)SPA培养基:5g蛋白胨,20g蔗糖,0.5gKH2PO4,0.25gMgSO4,1000mL蒸馏水,分装,121℃灭菌20min,最终pH值为7.2-7.4.

.2.3供试番茄

金石王1号番茄实生苗培育2-3叶期幼苗,5-6叶期成苗番茄种苗购自厦门如意集团农业科技有限公司.

4.3试验方法

4.3.1植物疫苗工程菌FJAT-1458胁迫接种和取样方法

番茄种苗为穴盘苗,购自厦门如意集团有限公司,将番茄种苗移栽至盆钵种植,盆钵直径15cm,高10cm,每盆装无菌土3kg,每盆移栽1株番茄苗(尽量选择长势一致的苗),当番茄植株生长至4~5叶期,将发酵培养的植物疫苗工程菌FJAT-1458菌液稀释至3.5×106/mL,采用伤根后灌根接种番茄植株,50mL/盆,共处理80盆,对照灌根相应量的清水,处理80盆.处理后的番茄植置于人工气候室培养(温度为30℃).在接种后5天,10天,15天,20天和25天后取样,取样时间为上午8:30—9:00,每个处理随机取10株番茄植株,去除根部泥土,清水冲洗干净,控干,-80℃冷冻保存备用.

4.3.2生物指标测定

根系长度及株高采用最小刻度为1mm的刻度尺测量,根系干重采用烘干法测定[129].

4.3.3酶活性的测定POD,PPO和SOD粗酶液提取方法:分别取1.0g根部,茎部和叶片,分别加入10mL0.05mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)研磨后于8000rpm离心10min,上清液转入25mL容量瓶中.沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取2次,上清液并入25mL容量瓶中,定容后低温下保存备用.SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法,参照李合生等[]方法.POD活性测定:采用愈创木酚氧化法,参照李合生等[]方法.PPO活性测定:参照贺忠群等[]方法.4.3.4数据统计分析

实验数据利用DPS统计软件,结合LSD(Least-SignificantDifference)法对统计结果进行显着性方差分析.不同处理间不含相同英文字母表示差异显着(P<,0.05),含有相同英文字母表示差异不显着(P<,0.05).

4.4结果与分析

4.4.1植物疫苗胁迫对番茄植株生长的影响

由表4-可知,在取样期间,植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458胁迫接种后番茄植株平均根系长度为16.70cm,略小于对照组16.87cm,差异不明显(P等于0.744),与对照组相比,植物疫苗无致病力青枯雷尔菌FJAT-1458胁迫下根系的平均干重增加了1.98%.此外,植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458胁迫对番茄株高未产生明显影响.表4-1菌株FJAT-1458胁迫对番茄植株生长的影响

Tab.4-1EffectsofbacterialstrainFJAT-1458ontomatogrowth

不同处理时间/d根长/cm根系干重/g株高/cm对照组处理组对照组处理组对照组处理组514.933±0.698a15.266±0.924a0.058±0.002a0.054±0.003a19.733±0.504a19.966±0.545a1015.900±0.700a15.500±0.472a0.060±0.005a0.057±0.002a24.200±0.466a24.600±0.608a1516.333±0.970a15.600±1.014a0.064±0.005a0.058±0.005a31.166±0.441a31.800±0.218a2017.033±0.348a17.300±0.929a0.068±0.009a0.074±0.008a35.400±0.519a35.366±0.64a2520.166±1.301a19.833±0.441a0.086±0.007a0.099±0.008a37.766±0.554a38.333±0.371a

4.4.2植物疫苗胁迫对番茄植株抗氧化酶系活性的影响

4.4.2.1对番茄植株不同部位SOD酶活性的影响

由图4-1可知,植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458胁迫接种后番茄植株不同部位SOD酶活性总和均显着高于对照(P≤0.05),番茄植株根部SOD酶活性总和最高,其次为茎部,叶片最小.植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458处理后番茄植株不同部位(根,茎,叶)SOD酶活性均高于对照.在根部,处理组和对照组的SOD酶活性都随时间呈先升后降的趋势,且都是在接种后第10天时最大,此时处理组和对照组的SOD酶活性比值为1.37,而随着胁迫时间的延长,比值逐渐趋于1.0(图4-2,表4-3).在茎部,处理组的SOD酶活性随时间呈先升后降的趋势,而对照组的SOD酶活性随时间变化不明显,在处理后的第10天处理组和对照组的SOD酶活性比值最大为2.09(图4-3,表4-).在叶片,处理组和对照组的SOD酶活性均呈现先升后降的趋势,且SOD酶活性变化均在接种后第10天时最大(图4-4).表4-2菌株FJAT-1458对番茄植株不同部位SOD酶活性的影响U/(g·FW)Tab.4-2EffectsofbacterialstrainFJAT-1458onSODactivityindifferentpartsoftomato(U·g-1FW)

接种天数/d根部SOD酶活茎部SOD酶活叶片SOD酶活处理组对照组比值处理组对照组比值处理组对照组比值528.23±0.9722.53±0.831.2525.00±0.6616.46±0.531.5221.16±0.8613.43±1.521.581033.08±0.3524.14±0.381.3731.62±1.0915.15±1.312.0927.07±1.7416.67±0.451.621525.56±0.5319.14±1.661.3424.09±0.4016.57±0.611.4518.23±1.1412.12±1.311.502022.37±0.2311.87±0.531.8921.11±0.7615.15±1.521.3916.52±0.6110.61±0.401.562516.06±0.5514.85±1.181.0815.25±0.4816.36±0.660.9312.07±0.8311.87±0.891.02

图4-1菌株FJAT-1458对番茄植株不同部位SOD酶活性总和的影响

Fig.4-1EffectsofstrainFJAT-1458ontotalSODactivityindifferentpartsoftomato图4-2菌株FJAT-1458对番茄植株根部SOD酶活性的影响

Fig.4-2EffectsofstrainFJAT-1458onSODactivityratiointherootsoftomato图4-3菌株FJAT-1458对番茄植株茎部SOD酶活性的影响

Fig.4-3EffectsofstrainFJAT-1458onSODactivityratiointhestemsoftomato图4-4菌株FJAT-1458对番茄植株叶片SOD酶活性的影响

Fig.4-4EffectsofstrainFJAT-1458onSODactivityratiointheleesoftomato

4.4.2.2对番茄植株不同部位POD酶活性的影响

由图4-5可知,植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-1458胁迫接种后番茄植株不同部位POD酶活性总和均显着高于对照(P≤0.05),处理组番茄植株根部POD酶活性总和最高,而对照组番茄植株茎部POD酶活性总和最高.处理组和对照组POD酶活性的总体变化趋势和出现的高