本站原创摘 要 以酮为模板分子,三氟丙烯酸为功能单体,乙二醇二丙烯酸酯为交联剂,合成了对类农药具有高选择性的分子印迹聚合物.将印迹聚合物作为固相萃取填料,优化分离、富集类农药的最优上样、淋洗和洗脱条件.结合液相色谱串联质谱法,实现了果蔬样品中20种类杀菌剂的高通量特异性检测.对样品前处理过程中的加标回收率进行了考察,并对比了分子印迹固相萃取和ENVICarb/SPE小柱的基质效应.结果表明：在1.0, 2.0 和10.0 μg/kg加标水平下,类农药的回收率在 81.0%～109.7% 之间,相对标准偏差小于12.6%,基质效应在 91.1%～121.8%之间.方法灵敏、准确度高,与ENVICarb/SPE 小柱相比,能更有效减弱基体效应.
关 键 词分子印迹聚合物； 固相萃取； 类农药
1.引 言
类杀菌剂是指含有1,2,4环的化合物,由于具有低毒、内吸性强、持效期长等优点,被广泛应用于水果、蔬菜、稻谷等病虫害的防治 [1～3 ].随着类农药的广泛应用,其在农产品和环境中的残留问题,也逐渐引起人们的重视.对其在食品和环境中的残留分析需要从复杂的基质样品中将低浓度的目标化合物高效提取和净化,因此对样品前处理提出较高要求.而传统上广泛使用的固相萃取技术特异性不强,常发生杂质共萃取现象 [4,5 ].因此亟待开发一种快速、灵敏、特异的检测技术.
分子印迹聚合物（MIPs）能够选择性提取复杂样品中的目标分子或与目标分子结构相似的化合物, 适合作为固相萃取的材料 [6～8 ].与传统的固相萃取柱相比,分子印迹固相萃取（MISPE）克服了试样体系复杂、预处理繁琐等不利因素,提高了分析准确性,更适用于痕量分析 [9～12 ].类化合物的MISPE方法已有少量文献报道,彭畅等 [13 ]采用邻硝基苯酚为替代模板,4乙烯基吡啶为功能单体,合成了对7种类化合物具有特异性吸附的印迹聚合物,并应用于土壤样品的分析中.
本研究以酮为模板分子,三氟丙烯酸为功能单体,合成了对20种类农药具有高选择性的MIP材料.MISPE结合液相色谱串联质谱法,实现了果蔬样品中类杀菌剂残留的特异性分离富集和检测,方法快速、灵敏、准确度高,与现有SPE技术相比,有效降低了样品基质效应.
2.实验部分
2.1 试剂与仪器
Agilent 1200液相色谱仪（美国Agilent公司）,API 4000液相色谱串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；E811全自动索氏提取仪（瑞士Buchi公司）.
酮等农药标准品（Dr. Ehrenstorfer公司）；三氟丙烯酸（Trifluoromethyl acrylic acid, TFMAA）,乙二醇二丙烯酸酯（Ethyleneglycol dimethacrylate, Egdma）,均为分析纯（SigmaAldrich公司）,使用前纯化；偶氮二异丁腈 （Azobisisbutyronitrile, AIBN,化学纯,上海试剂四厂）；乙酸（分析纯,国药集团）；乙腈、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、甲苯（色谱纯, 美国Tedia公司）.石墨化碳黑SPE柱（ENVICarb/PSA PE,0.5 g, 6 mL,美国SigmaAldrich公司）.
2.2 标准溶液的配制
分别称取酮等农药标准品（纯度>99.5%）各10～20 mg, 溶于乙腈并定容至 100 mL,配制成100～200 mg/L标准储备液.混合标准中间液以单标储备液稀释配制而成,浓度为1.0 mg/L, 混合标准工作液（0.2, 0.1, 0.05, 0.02, 0.01, 0.005和0.001 mg/L）由混合标准中间液用乙腈逐级稀释而成.
2.3 实验方法
色谱柱为Waters C18柱（100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm）；柱温：40 ℃；流速：200 μL/min；进样量：10 μL；流动相：乙腈（A）,10 mmol/L乙酸铵溶液（B）；梯度：0～5 min,10%～30% A；5～15 min,30%～50% A；15～25 min,50%～95% A；25～25.1 min,95%～10% A；25.1～35 min,10% A.
电喷雾电压：5500 V；雾化气压力： 4.14 MPa；气帘气压力：1.38 MPa；辅助气流速：4.14×103； 离子源温度：450 ℃；正离子多反应监测；碰撞气：Medium；,定性离子对和定量离子对的去簇电压（Declustering potential,DP）、碰撞能量（Collision energy,CE）见表1.
2.4 印迹聚合物制备
将1 mmol酮溶于60 mL三氯甲烷甲苯（2 ∶ 1, V/V）中, 加入4 mmol TFMAA,超声1 h,使酮与TFMAA充分作用；加入20 mmol EGDMA和60 mg AIBN,超声0.5 h,充分混溶后,通N2脱氧30 min,真空状态下密封；将其放入60 ℃的恒温水浴中反应24 h,取出,干燥,研磨过筛, 以甲醇乙酸（9 ∶ 1, V/V）为提取剂,索氏提取24 h； 用甲醇洗至中性,在25 ℃下真空干燥过夜,得到印迹聚合物MIPs.非印迹聚合物（Nonimprinted polymers,NIPs）的合成除不加分子模板酮外,其余步骤同上.
2.5 酮分子印迹的平衡吸附实验
取MIPs以及NIPs各50 mg放入具塞试管中,分别加入10 mL不同浓度（0～2.6 mmol/L）的酮溶液,涡旋10 min.计算其吸附量Q,由Q作结合等温线图,并进行Scatchard分析. 聚合物吸附率的计算公式：Q等于（C0-Ct）V/m, 单位（μmol/g）, 其中C0为酮的原始浓度, Ct为酮吸附过程中的平衡浓度, V为酮溶液的体积, m为聚合物的质量.
2.6 样品的预处理
称取5.0 g（准确至0.01 g）粉碎后的样品于50 mL离心管内,加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1, V/V）涡旋混匀提取2 min ,以3000 r/min离心5 min,将上清液转移至浓缩瓶中.在离心管中再加入20 mL提取液,重复上述操作,合并提取液,在40 ℃以下,浓缩至近干,用2 mL乙腈清洗,用水定容至10 mL,待净化.
2.7 固相萃取实验
2.7.1 MISPE柱的制备及萃取条件优化 称取50 mg MIPs加入到空SPE柱中,加入筛板,压紧制成MISPE柱.将类混标溶解在不同的溶剂中配成0.10 mg/L的溶液,取10 mL溶液过柱,采用不同溶剂进行淋洗和洗脱,收集洗脱液,吹干后溶解于10 mL乙腈中,用LCMS/MS测定.考察不同的上样、淋洗、洗脱条件下MISPE柱对20种类农药的保留能力.
2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱对实际样品中类物质的分离、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱,将2.6节预处理制得的10 mL类溶液,以不超过1.0 mL/min的流速过柱, 用2 mL 20%乙腈洗涤,最后用5 mL乙腈洗脱.
ENVICarb/PSA SPE：柱中加入约2 cm高的无水硫酸钠,用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1,V/V）活化柱体.样品参照2.6节净化处理后,用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1, V/V）分3次洗涤浓缩瓶.将上述提取液倾入柱中,收集流出液.
2.8 基质效应
空白样品按照上述前处理方法处理后,在空白基质中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的类标准品,通过比较含样品基质的标准化合物的峰面积与溶解在纯溶剂中化合物的峰面积之比计算基质效应.
3.结果与讨论
3.1 致孔剂对聚合物的影响
致孔剂不仅影响着聚合物的形态和结构,且在聚合时控制非共价键结合的程度,在分子印迹制备中发挥着重要作用 [14,15 ].在非共价印迹体系中,致孔剂要对试剂有较高的溶解性,且不干扰模板和单体之间的相互作用.为了研究致孔剂对聚合物的影响,选用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分别为致孔剂合成了分子印迹聚合物,用扫描电镜进行表征.从图1可见,以乙腈为致孔剂得到的是大孔型聚合物且孔结构不均匀；以氯仿为致孔剂的聚合物孔结构致密,模板分子不易被洗脱,会造成模板泄露问题,且聚合物坚硬、密实,研磨费力.在氯仿中加少量甲苯发现,聚合物的硬度明显变软,呈现高度交联的微孔结构,这些孔结构增加了聚合物的表面积,同时聚合物的多孔结构有效避免了后续处理中模板分子难以洗脱分离的问题,从而为模板分子的吸附和洗脱提供了条件.
[TS（][HT5”SS] 图1 不同致孔剂制备的分子印迹聚合物的扫描电镜图
Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens
A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷与甲苯的混合溶剂（Chloroformtoluene mixtures）. [HT5][TS）]
3.2 吸附性能研究
通过静态吸附实验研究了酮MIPs和NIPs上的吸附性,吸附等温线如图2.随着酮浓度的增加,MIPs对酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明显高于NIPs的吸附量,这是由于酮与三氟丙烯酸之间通过氢键形成了特异性的结合位点.NIPs的内部由于不具有特异性的结合位点,主要依靠聚合物表面的非特异性吸附作用,无法对模板分子进行有效地识别.对吸附时间动力学也做了研究,结果发现,涡旋10 min后,酮在MIPs的吸附达到饱和.