本站原创摘 要 ：以水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）两优１７为试验材料进行标准发芽后,对幼苗进行大苗、小苗分类,并利用ＳＳＲ引物分别对其进行室内纯度鉴定.鉴定结果表明,苗的大小对鉴定结果的影响较大,小苗与大苗的纯度相差２．８个百分点,超出了允许的误差范围.与大田相比,大苗的纯度更接近于田间秧苗纯度.在田间小苗往往不能成苗,不影响大田纯度,故小苗是造成室内与大田纯度鉴定结果产生差异的重要原因之一.
关 键 词 ：水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）；ＳＳＲ；室内；田间；纯度鉴定
中图分类号：Ｑ７８９；Ｓ５１１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）17－3687-02
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ－ｌｉｎｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ （ＳＳＲ）Ⅱ．Effects of Sampling Methods on Laboratory Purity Detection
ＬＩＡＯ Ｆａｎｇ-ｌｉ1,ＺＨＡＮＧ Ｙｕ-ｆｅｉ1,ＬＩＮ Meｉ1,ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ1,ＸＩＯＮＧ Ｘｉａｎ-ｆｅｎｇ1,ＴＵ Ｓｈｕ-ｘｉｎ2,ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ3
（１．Ｓｅｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｎｇｚｈｏｕ, Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２０,Ｈｕｂｅｉ,Ｃｈｉｎａ； 2．Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ, Ｗｕｈａｎ ４３００７０,Ｃｈｉｎａ；
3． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ, Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ,Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５,Ｈｕｂｅｉ,Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ Ｌｉａｎｇｙｏｕ１７ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ｌａｒｇｅ or ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＳＳＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ａｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ 2．8％, ｗｈｉｃｈ ｅｘｃｅｅｄ ｔｈｅ ａｌｌｏｗａｂｌｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｎｇｅ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｉｅｌｄ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ, ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈａｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｆｉｅｌｄ ａｓ ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｍａｔｕｒｅ ｔｈｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｅｄｓ ｐｕｒｉｔｙ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）； ＳＳＲ； ｉｎｄｏｏｒ, ｆｉｅｌｄ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）的种子发芽率和成秧率是两个概念,前者表示在规定条件和时间内长成的正常幼苗占供检种子数的百分率,后者表示百个芽苗大田形成正常植株的株数.前人用ＳＳＲ标记检测种子纯度时,用于提取ＤＮＡ的材料大多来自两个途径［１-１０］,一是在田间植株上直接剪取叶片,二是在发芽箱内培养幼苗.第一种方法由于省去了种子样品发芽、成秧等环节,其结果与原样品实际纯度有所差异；第二种方法由于发芽箱条件往往设定为种子的最适发芽环境,很多在田间不能成苗的种子在室内可以长成弱苗或残苗,在取样时,根据操作规程,这类小苗都被当成鉴定对象进行了检测.这一批在大田有可能不能成秧的幼苗是否会影响到室内鉴定结果与大田生产中实际纯度的吻合性,目前尚未见报道.本试验模拟田间成秧率取样,探索ＤＮＡ模板制备前,按室内标准发芽方法获得的大苗、小苗对种子纯度鉴定结果的影响,从而寻求减少或修正利用ＳＳＲ引物鉴定室内与田间纯度之间误差的途径.
１ 材料与方法
１．１ 材料
所用杂交水稻品种两优１７及其亲本均由湖北省种子管理局统一提供.
所用引物及试剂均由北京鼎国生物有限公司提供.
１．２ ＰＣＲ反应体系
ＰＣＲ扩增反应总体积１０ μＬ ：１０×ｂｕｆｆｅｒ １ μＬ,１０ ｍmol/L ｄＮＴＰ ０．２ μＬ,５０ ｎｇ／μＬ ｐｒｉｍｅｒ ０．２ μＬ＋０．２ μＬ,２ U／μＬ Ｔａｑ酶 ０．６ μＬ,２５ ｎｇ／μＬ ＤＮＡ １ μＬ,ｄｄＨ２Ｏ ６．８ μＬ.ＰＣＲ扩增程序：９４℃预变性４ ｍｉｎ； ９４ ℃变性１５ ｓ,５５ ℃退火１５ ｓ,７２ ℃延伸３０ ｓ,３５个循环；７２ ℃下延伸７ ｍｉｎ.扩增产物在浓度为３％、含ＥＢ的琼脂糖凝胶中进行电泳后应用凝胶成像系统观察记录.
１．３ ＤＮＡ模板制备和引物筛选
ＤＮＡ模板的制备采用农业部推荐的简易提取ＤＮＡ法.采用１０个单株幼苗抽提的ＤＮＡ混合物做模板,以消除杂株可能对筛选结果的干扰,然后用农业部推荐的４４对两系杂交种常用ＳＳＲ引物分别对两优１７及其父母本ＤＮＡ进行扩增,扩增产物在含EB的３％的琼脂糖凝胶电泳后成像观察.从中筛选出多态性高、共显性强、谱带清晰、杂株检出率高的引物ＲＭ２１鉴定两优１７.
１．４ 室内大苗和小苗的分类及纯度鉴定
从两优１７中随机抽取９００粒种子,按ＧＢ／Ｔ ３５４３．４—１９９５进行发芽试验.发芽两周后按苗高分成两类：小苗≤３ ｃｍ,大苗＞３ ｃｍ.将这两类苗分别用ＲＭ２１引物进行纯度鉴定.