本站原创摘 要 ：传统PCR技术虽然因为其灵敏性、特异性和快速性,自发明以来取得了广泛应用,但仍存在容易交叉污染而产生检测阳性及定量不准确的缺陷.而实时荧光定量PCR（RQ-PCR）技术实现了从定性到定量的飞跃,由于其操作方便、反应速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为了分子生物学研究中的重要工具.
关 键 词 ：RQ-PCR；荧光探针；分子生物；荧光共振能量转移
中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）13-0044-02
1.RQ-PCR技术概述
RQ-PCR是FPET（荧光共振能量转移）技术在PCR定量上的应用.其指在PCR反应体系中加入荧光基团,在指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及强弱变化实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.RQ-PCR同步进行定量和扩增,这样就克服了传统PCR的平台效应,减少了终点检测带来交叉污染的机会,也克服了终点法定量的不准确性.另外,RQ-PCR无需再处理,节约了时间和精力,更避免了放射性同位素可能给实验人员造成的伤害.目前,RQ-PCR在分子生物学研究中应用越来越多.
1.1 荧光共振能量转移
当一个荧光基团的荧光光谱与另一个荧光基团的激发光谱重叠,并且两个基团距离足够近时,供体荧光基团的激发能诱发受体基团发出荧光,同时供体荧光基团自身的荧光强度衰减,即能量从短波长的荧光基团传递到长波长的荧光基团,相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽,这个过程称为FRET.
1.2 参照物
参照物有外参照和内参照两种.外参照不与目的基因在同一反应体系中扩增.以已知浓度的目的基因为模板按一定比例稀释,制备标准曲线.而未知标本则根据该标准曲线得出相对的拷贝数和Ct值.其优点是可以和目的基因保持较高的同源性,保证了二者的扩增效率近似.缺点是不能克服也无法检测可能出现在样本反应体系中的影响因素.内参照是在各标本中加入已知浓度的内参照基因,与样本一起抽提、扩增.内参照基因的DN段与目的基因相似.为保证目的基因只能与内参照探针结合,运用定点突变的方法改变与探针结合的中间部位的序列.内参照系统的结果重复性更好,可以避免不同抽提效率导致的样本间差异.
1.3 RQ-PCR几个重要参数
（1）荧光域值3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍设置为荧光域值的缺省,荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号；（2）Ct值中C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；（3）Ct值与起始模板的关系研究表明,每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,当获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.
2.RQ-PCR技术的关键
RQ-PCR技术在常规PCR基础上添加了荧光染料或探针.特异的将双链DNA掺入荧光染料中,保证其信号与PCR产物完全同步递增.在探针的3’端和5’端分别标记淬灭基团（Q）和报告基团（R）,进行能量的传递.R基团所发出的荧光可被Q基团吸收或抑制；抑制作用随着两者距离变远而消失,R基团增强后的荧光信号可以被荧光监测系统接收到.当荧光信号增强到某一阈值时,Ct值被记录下来.这样,通过未知样品的Ct值和标准曲线就可以将该样品的起始拷贝数确定.因此,在RQ-PCR中,荧光染料或探针就成为了技术关键.目前已经开发出的荧光染料和探针按照能量转移和基团标记的方式,大体可以分为水解类探针和杂交类探针两类.
2.1 Taq Man探针法
在该探针的3’末端和5’末端分别标记Q基团和R基团,使其与两引物所包含的一段序列内DNA模板完全互补.当探针完整时,利用Taq酶5’→3’外切酶的活性,Q基团吸收R基团的荧光,荧光信号也就不能被检测到；相反如果正确的底物被扩增出来后,即有特异的PCR发生时,探针就会在复性阶段与其杂交,当聚合酶延伸到探针时,它就会将与模板杂交上的探针切碎,使得R基团和Q基团分开,解除淬灭作用,从而释放出荧光信号,可通过检测系统观察到信号的变化.每扩增一条DNA链,就会有一个游离的荧光分子形成,实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同步,进而计算出Rn值、△Rn值、Ct值和阈值.通过计算就可以获得起初模板量.常用的荧光基团是VIC、TET、FAM、HEX.
2.2 非特异性双链DNA嵌入染料
SYBR Green 1是一种与双链DNA结合的染料.当它游离在溶液中时,不发出荧光；但当其掺入DNA双链后,会发出强烈荧光.该染料最大的优点是可以作用于任何模板的任何引物.但由于其对DNA模板没有选择性,可能会造成定量不准确.若想解决这个问题,可以使用比较由于融解曲线法,还可以通过反应条件的优化及严格设计高特异性引物,降低引物二聚体形成的可能性.
2.3 分子信标
分子信标由Tyagi和Krammertm建立,适用于鉴定点突变.该探针是单链DNA所形成的呈发卡结构的茎环双标记寡核苷酸,环部部分碱基同靶DNA序列互补,长度为15～35个核苷酸；茎部有互补配对的碱基组成,同靶DNA无序列同源性,约5～7个核苷酸长.在探针的5’端标记R基团,3’端标记Q基团.当分子信标游离时,由于R、Q两个基团紧密相邻,荧光被淬灭.而在PCR变性后的复性阶段,分子信标与溶液中的特异模板杂交,靶DNA序列与分子信标环部的核苷酸序列互补结合,使发卡结构破坏,释放出荧光信号,淬灭作用被解除.由于荧光强度会随着分子信标量的增加而增加,从而达到定量检测的目的.在PCR的延伸阶段,分子信标与模板解离,再次形成发卡结构,荧光消失.每次扩增后产物的积累量可以通过当时的荧光强度的增加来反映.该方法的优点是探针可循环利用,缺点是标记相对复杂.同时,茎部结构的高热力学温度会影响探针和靶序列的杂交. 2.4 杂交探针
双杂交探针也是以FRET为原理进行的.该方法使用四个寡聚核苷酸分子、两个引物和两个探针.发光探针的5’端标记一个R基团,淬灭探针的3’端标记Q基团,杂交时R基团紧密相邻Q基团,以首尾相接的方式退火靶扩增子,当循环仪的光源激发3’端的Q基团后,产生从供体到毗邻探针R基团的FRET使荧光淬灭.起始模板的量越高,荧光淬灭的程度越低,以此可以进行PCR的定量分析.该方法的优点是淬灭效率高,缺点是扩增效率不稳定,合成成本相对较高.
3.RQ-PCR技术的应用
3.1 基因工程研究领域
RQ-PCR技术的出现加强了对基因的量和质变化的研究.它目前已经在遗传分析中广泛应用以检测基因突变及基因组的不稳定性.
（1）基因表达研究由于探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关,可以将由不同荧光报告基团标记的探针与野生型和突变基因杂交,2005年刘敬忠等使用RQ-PCR技术对β地中海贫血纯、杂合子作出诊断.目前对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治,而应用RQ-PCR技术可以通过产前监测和产前基因诊断来减少病婴出生.
（2）转基因研究Tesson等确定了分析转基因鼠接合性的RQ-PCR技术使用条件,利用合适的循环域值及发光探针,扩增一个转移后的基因和一个对照基因.通过RQ-PCR检测,同型结合的和异质接合的动物交配后其子代中转基因的传递情况与孟德尔遗传规律相符.这项技术可以广泛地应用于基因剂量功效实验和转基因动物的繁育中.
（3）单核苷酸多态性与突变的分析RQ-PCR可以用来检测基因突变和基因组的不稳定性.一条横跨突变位点的探针和一条锚定探针是检测基因突变的基础.两条探针用两种不同的发光基团标记.如果靶序列中无突变,探针杂交便完全配对；如果靶序列和探针不完全配对,会降低杂交体的稳定性和熔解温度.这样便可对突变和多态性进行分析.
3.2 医学研究领域
（1）病原体检测2000年苏学飞等利用该技术对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类瘤病毒、单纯疱疹病毒五个项目进行了定量测定.2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得RQ-PCR技术得以应用和发展.近年来,TaKaRa公司推出的试剂盒可以一步完成对H5N1、H7N9等禽流感病毒的检测.
（2）肿瘤诊断基因发生了变异是肿瘤产生的根本,RQ-PCR方法可以将这些异常变化都检测出来.许多癌基因的突变和表达增加,在肿瘤早期就出现.除了能够有效地检测基因突变,RQ-PCR还能够准确地检测到癌变基因的表达量.随着与肿瘤相关的新基因被不断地发现,会使RQ-PCR技术在肿瘤的研究中发挥越来越大的作用.
（3）抗药性考核日本Funato等使用RQ-PCR技术对临床样品中如MRP、MDR21等与抗药性相关的基因表达进行了检测.结果表明,RQ-PCR技术可以可靠地定量检测抗药基因的表达,运用该技术可以对化疗可能引起的反应进行预测.
4.结语
现在,RQ-PCR技术不仅快速、灵敏、准确,而且己经发展为一项高度自动化的核酸定量技术,大大降低了检测阳性率,提高了工作效率,且不必使用对人体有害的染色剂.因此该技术被广泛地应用在基因表达研究、基因单核苷酸多态性和遗传性疾病诊断、病原微生物诊断等诸多科研领域.但与传统的PCR技术相比,RQ-PCR也存在不足之处：（1）RQ-PCR在复合式检测方面的应用能力会因检测光源和荧光素种类的局限所限制；（2）由于检测环境相对封闭,减少了扩增后电泳的检测步骤,也就无法对扩增产物的大小进行监测；（3）RQ-PCR实验的高成本也限制了其广泛的应用.