本站原创【摘 要】溶解态铜（Cu）在水体中以络合态与游离态的形式存在,通过吸附以及吸收等方式进入藻细胞,从而影响其生长和生理代谢.然而,受研究方法限制,我们对藻类吸收利用Cu机制仍不十分清楚.本文在添加了系列浓度Cu的培养基中培养三角褐指藻,采用了一种草酸清洗以分离细胞壁上吸附态与内态Cu的方法,来研究不同铜浓度的条件下,藻类吸收利用Cu的过程.结果表明：由于EDTA的存在,培养基中的Cu大部分以络合态形式存在,游离态Cu2+浓度很低,但是,微量的Cu2+对藻的生长代谢也有一定影响；随着培养基中Cu2+的增加,细胞吸附态Cu显著增加,而内态Cu有少量增加,反映了生物的自我保护机制.通过模拟,藻细胞吸附与吸收Cu的方程为： y吸附等于exp（0.58*ln（x） - 0.22）,R2等于0.97,y吸收等于exp（0.57*ln（x） - 1.68）,R2等于0.94.
【关 键 词 】铜；吸附吸收机制；草酸洗液；三角褐指藻
1.前言
近年来,含Cu等重金属的工农业废水、城市生活污水以及采矿废水等向水体大量排放,使水体环境中Cu含量显著增加[1,2].Cu对生物体扮演双重角色,低浓度时参与新陈代谢反应[2],但超过一定的阈值则对生物体有毒性作用[3].除了用总溶解态Cu来指示其对生物的影响外,Cu在水体中的存在形态也是很重要的指标：溶解态Cu大部分以络合态的形式存在,游离态Cu2+在水体中含量很少,当被吸收至细胞内时,会影响生物的生长生理代谢[4].先前有很多针对水体中高浓度Cu与藻相互作用的报导[5,6],但对于微量Cu2+的存在条件下,藻细胞如何吸收Cu的研究较少.目前用于研究生物吸收吸附金属的方法尚有不足,因此需要建立一种新的方法来做更深入的探索.
三角褐指藻（Phaeodactylum triconutum）属于硅藻门,羽纹纲,褐指藻目,褐指藻属.近岸水体发生藻华时,硅藻常常是优势种,而三角褐指藻的分布范围较广且易于在实验室内进行培养,因此常被用来作为海洋浮游生物毒性测试的实验材料.本文用添加了不同浓度Cu的培养基对三角褐指藻进行培养,利用草酸洗液清洗的技术高效分离出细胞内态的Cu和细胞壁上吸附的Cu,对藻细胞吸附吸收Cu的机制进行探讨.
2. 材料与方法
2.1 实验材料
三角褐指藻 （Phaeodactylum triconutum Bohlin）,strain CCMA 106,于2004年在南海中分离,由厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室的海洋微型生物保种中心获取.培养基由过滤后的南海表层海水（Seats站：116°E, 18°N）添加Aquil溶液[7]制得.藻在正式应用于实验之前,培养20个世代,温度维持于20 ± 0.5 ℃,用冷白色荧光灯管照明,光强为140 mol photons.m-2.s-1,光暗周期比是12∶12 h.添加生长良好的指数生长期的藻液于培养基内进行培养.
2.2 实验方法
2.2.1 培养
实验所用培养液与器皿均经高温灭菌消毒.实验采用Nalgene 4L圆柱形瓶,在GXZ智能型光照培养箱（宁波江南制造厂,中国）内20℃恒温培养,光照强度为140 μmolm-2s-1,光暗周期比为12∶12 h.培养基中加入CuSO4的浓度依次为：0 μmolL-1, 0.25 μmolL-1, 0.5 μmolL-1, 1.0 μmolL-1, 2.0 μmolL-1, 4.0 μmolL-1, 8.0 μmolL-1, 16.0 μmolL-1,每个浓度设3个平行样.在上述的浓度下,三角褐指藻的初始接种密度为85000 cellL-1,经过72h的培养后取样处理测定.
2.2.2 细胞内金属以及细胞吸附态金属的区分和测定
实验采用Tovar-Sanchez等在2003年报导的使用草酸洗液清洗藻细胞的方法来区分细胞壁上吸附的以及细胞内的Cu[8].该方法的原理为：细胞壁上吸附有铁氧化物,Cu等金属会吸附在这些铁氧化物上,当添加草酸洗液时,其主要成分草酸溶液会和细胞壁上的铁氧化物发生氧化还原反应,进而洗去吸附在细胞壁上的金属.同时草酸洗液中也添加了EDTA以及柠檬酸盐等具有螯合性的试剂,提高了去除吸附态金属的效率.该方法可以去除97%的吸附态金属,且不会导致细胞裂解.草酸洗液还具有稳定性强,便于在实验室中操作的特点,因此可以用来高效的区分细胞内部以及细胞壁上吸附的金属.
培养72 h后,将样品拿至100级的洁净室内,用量筒取100 mL藻液,经过0.45 μm聚丙烯膜过滤.将滤膜放置于消解罐中,加入1.5 mL 浓HCl和0.5 mL浓HNO3,放置于配套的钢套中,于烘箱内170 ℃加热8 h.蒸干消解液,用3 mL 2% HNO3再溶解,最后用ICP-MS （Agilent 7700） 测定得总态Cu的含量Cutotal.
另取100 mL藻液,经过0.45 μm聚丙烯膜过滤后,向滤膜上加入5 mL草酸洗液,在过滤器内部保持真空的状态下,使草酸洗液在滤膜上停留5 min,滤去滤膜上的液体以除去吸附于藻细胞壁上的金属.用同样的消解程序消解滤膜并测定得细胞内态Cu的含量Cuintracellular.
细胞吸附态Cu为测得的总态Cu与细胞内态Cu的差值：Cuadsorbed等于Cutotal - Cuintracellular .
为了减少实验分析中可能带来的污染,处理金属样品中所用到的滤膜、滤器、消解罐等实验材料均经过严格的清洗程序,酸用亚沸蒸馏系统纯化处理.
3. 结果与讨论
实验数据采用Excel 2003,Origin 6.0以及MINEQL+ 4.6软件进行处理分析. 3.1 藻的生长、生理参数变化
实验结果显示,Cu浓度的增加对三角褐指藻生长有略微促进作用（μ： 0.53-0.74）,而对生理活动有毒性作用（Fv/Fm： 0.55-0.51； ETRmax： 70.58-57.68, 未发表数据）,即会促进三角褐指藻的生长但对生理活动有毒性作用.
3.2 培养基中游离态Cu2+浓度的计算
重金属的存在形态直接影响着它的迁移转化以及生物对金属的利用.前人研究发现：若溶液中存在EDTA,则大部分Cu被EDTA络合而存在于溶液中,真正对生物起作用的是Cu2+,且浓度很低[9]；铜对藻类的毒性也会由于有机试剂和溶解有机碳的络合作用而降低[10],主要是由Cu2+、CuOH+、Cu（OH）2（aq）引起[11].
为了得到我们培养条件下Cu2+浓度,结合海水中常量离子的浓度,利用MINEQL+ 4.6软件进行计算,结果如表1所示.当CuSO4加入量是0 μmol/L时,溶液中Cu2+的含量为0.02 nmol/L,即Aquil培养基中所含的Cu的背景值.我们用数据证实了,即使培养基中添加大量Cu （0-16 μmol/L）时,由于EDTA的存在,游离Cu2+浓度却很低（0.02-26.3 nmol/L）.因此,在野外实际调查和进行环境监测时,不能只关注总溶解态Cu的浓度,还应该结合有机物的浓度来判断Cu对浮游植物的影响.
吸附态和细胞内态铜的含量
3.3 Cu2+浓度变化对藻细胞吸附和吸收Cu的影响
如图1所示,随着溶液内Cu2+浓度的变化,细胞壁上吸附的和细胞内的Cu都有升高趋势,且大部分吸附在细胞壁上,进入细胞内部的量较少,体现了生物的自我保护机制.王宪等人[12]认为藻类吸附吸收金属离子分为两步,第一步与代谢无关,通过配位、螯合或离子交换等作用中的一种或几种将金属离子快速的吸附至细胞表面；第二步：金属被送至细胞内,该过程进行得较慢.为了更确切的了解藻细胞吸附吸收Cu的过程,本文对得到的结果进行模拟,得到细胞吸附吸收Cu的方程.
检测设藻细胞吸收Cu为一级反应,则：
细胞壁吸附Cu的过程可表示为：
d[Cuaq]/dt等于 -k1[Cuad] （1）
细胞吸收Cu至细胞内部的过程可表示为：
d[Cuaq]/dt等于 -k2[Cuab] （2）
溶液中Cu2+浓度变化为：
d[Cu2+]/dt等于 -k3[Cu2+] （3）
其中：Cuaq―溶液中Cu的量；Cuad―细胞壁吸附Cu的量；Cuab―吸收到细胞内部Cu的量.k1―细胞壁吸附Cu的速率,k2―吸收至细胞内部Cu的速率,k3―溶液中Cu2+变化的速率,t为培养时间.
解微分方程得：
细胞壁吸附Cu的过程：
[Cuad]等于exp [K1 ln[Cu2+]+C1] K1等于k1/k3 （4）
细胞吸收Cu的过程：
[Cuab]等于exp [K2 ln[Cu2+]+C2] K2等于k2/k3 （5）
K1,K2为相对吸收速率,若K等于1,则吸附或吸收Cu的速率与溶液中Cu2+变化的速率相同；K>1则曲线为凹形；K<1则曲线为凸形.
通过origin 6.0软件非线性拟合得到：
细胞壁吸附Cu的过程：
yad等于exp（0.58*ln（x） - 0.22） R2等于0.97 （6）
细胞吸收Cu的过程：
yab等于exp（0.57*ln（x） - 1.68） R2等于0.94 （7）
由K1等于0.58,K2等于0.57可得,Cu被吸附到细胞壁上以及被吸收到细胞内部的速率均小于溶液中Cu2+浓度变化的速率,且吸附到细胞壁上的速率略大于从细胞壁吸收到细胞内的速率,也体现了生物的自我保护机制.
4.结论
即使培养基中加入了高浓度的Cu,由于EDTA等络合物的存在,真正对生物有影响的游离态Cu2+浓度很低；大部分的Cu吸附在细胞壁上,进入细胞内部的Cu量很少,体现了生物的自我保护机制；通过高效分离并测定细胞壁吸附态Cu以及细胞内部Cu的量,据此模拟并给出了吸附以及吸收方程,对进一步探讨细胞壁吸附Cu以及细胞吸收Cu的机理有重大意义.
致谢
感谢Kumar对藻的培养以及生物参数的测定；感谢高坤山老师组师兄师姐对疑问的解答,在此一并致谢.
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[12]王宪, 徐鲁荣, 陈丽丹等. 海藻生物吸附金属离子技术的特点和功能[J]. 台湾海峡, 2003, 22（1）： 120-124.
作者简介：
夏微微（1989-）,女,硕士研究生,主要从事海水中痕量金属分布与利用机制研究.