本站原创【摘 要】针对水中叶绿素含量测定步骤繁琐,操作过程损失多,人为干扰因素大等特点,在不改变原有方法的基础上,对叶绿素处理方式进行改进：用丙酮超低温冷冻萃取；超声波充分震荡破碎混匀；微孔滤膜进一步过滤去除杂质干扰.通过试验,发现新方法测定在很大程度降低了操作过程中人为因素的耗损,提高了检测效率和检测质量.
【关 键 词 】叶绿素a；分光光度法；醋酸纤维膜；丙酮；微孔滤膜
1.前言
随着现代经济的高度发展和人口膨胀,湖泊、水库正接纳越来越多的氮、磷等营养负荷,也使得浮游生物及其他水生生物异常繁殖,造成水体富营养化,严重影响供水水质.藻类计数和叶绿素含量的测定是用于评价水体富营养化水平的两大生物水质检测指标,利用显微镜对水中藻类计数耗时长、检测人员存在主观判断差异不同,测得的藻类计数结果往往相差较大.叶绿素测定受人为主观判断影响相对较小,含量比较稳定,因此,成为评价水质富营养化水平的主要水质指标.
2.叶绿素测定新方法
本文是根据《中国湖泊富营养调查规范》、《水与废水标准检验方法》第四版等资料提供的操作方法,在不改变原方法的基础上,对含藻水样经过过滤浓缩、冷冻萃取、超声波振动、再对离心后的水样进行再过滤,通过分光光度计测定萃取液中叶绿素的浓度.通过反复试验,取得了较好的试验结果.同原方法相比较,叶绿素测定含量提高了11.8%～23.3 %.
3.实验原理和材料
3.1 实验原理
分光光度法测定水中叶绿素含量的原理是以有机溶剂丙酮溶液直接提取浮游生物浓缩样中的叶绿素,测定其吸光度,根据叶绿素a在特定波长的吸收,用公式计算其含量.
3.2 试剂
（1）90%的丙酮溶液
（2）1%的碳酸镁悬浊溶液
（3）仪器设备及器皿
1）过滤装置：过滤器,醋酸纤维滤膜（直径50mm,孔径0.45um）、真空泵
2）台式医用离心机（最大转速4000r/min）、超声波仪、微漩涡器
3）器皿：研钵,微孔滤膜、镊子、剪子、塑料离心管、10mL标准容量瓶
4.测试方法的比较（方法Ⅱ为改进方法,方法Ⅰ为原有方法）
叶绿素测试步骤为：浓缩___萃取___离心___分光光度测定.两种方法的不同之处有以下两点：
4.1 萃取冷冻不同
方法Ⅰ：抽滤完毕后,用镊子小心去下滤膜放在培养皿中,置于冰箱低温干燥6～8个小时后加入2～3mL90%的丙酮研磨3～5min知道成液体状,倒入离心管中,反复冲洗研磨器,直至研碎醋酸纤维滤膜完全转出.
方法Ⅱ： 抽滤完毕后,立即用剪刀将滤膜剪碎,置于有螺帽的离心管中加入6～8mL 90%的丙酮浸泡,然后置于零下20度的冰箱中冷冻6～8小时
4.2 震荡效果不同
这一步非常关键,方法Ⅰ是纯手工搅拌,来保证滤膜和丙酮完全混合达到离心萃取的目的.方法Ⅱ则是利用微漩涡器和超声波震荡的原理对装有混合物的离心管进行避光震荡15min,萃取效果好.
5.实验结果
（1）多次试验发现,方法Ⅰ处理的叶绿素,在滤膜研磨过程中,形成大量碎屑悬浮于提取液中.《水与废水标准检验方法》第四版方法中要求OD750nm的吸光度不大于0.005,如果离心后不能很好地沉淀分离,是必对测定结果产生很大的影响,在OD750nm处的吸光度高,影响测定结果.
将醋酸纤维滤膜加入少量的碳酸镁悬乳液后,用蒸馏水代替水样按方法Ⅱ、方法Ⅰ进行处理,结果如下：
从这个实验结果得出：而方法Ⅱ正是通过微过滤来降低浊度影响,起到了很好地控制作用.
（2）本文以董铺水库原水为例,测定叶绿素a含量,通过多次调查研究实验,对2014年1月～2014年3月间五组数据进行方法试验比对,结果如下：
6.结果与讨论
从上表结果数据中得出：
方法Ⅰ在离心后OD750的光密度仍高于0.005,有时达到0.020.误差偏高,方法ⅡOD750的光密度严格控制在0.005以下；这是由于采用了微孔滤膜过滤去除,处理效果达到了《水与废水标准检验方法》第四版方法中要求OD750nm的吸光度不大于0.005的要求.
（2）由于通风效果不好,研磨中高浓度丙酮溶液的挥发对操作人员损害较大；方法Ⅱ减少这一环节,降低人为因素产生的耗损,也减少试剂对人的伤害.